Gram-kleuring
Gram-kleuring is een methode om bacteriën te kleuren om ze onder een lichtmicroscoop zichtbaar te maken en als hulpmiddel bij het herkennen van soorten.
De methode is genoemd naar de uitvinder ervan, de Deense microbioloog Hans Christian Gram (1853-1928), die de techniek in 1884 ontwikkelde voor het onderscheiden van pneumokokken (Streptococcus pneumoniae) van Klebsiella pneumoniae.
Met behulp van deze methode gekleurd, vallen bacteriën namelijk uiteen in twee verschillend aankleurende groepen, die men Gram-negatief (rood) of Gram-positief (blauwpaars) noemt.
[bewerk] Werking
De bacteriën worden eerst gekleurd met een kristalviolet - jodium complex, daarna ontkleurd met alcohol en vervolgens nagekleurd met waterige fuchsine. Bij Gram-positieve bacteriën wordt het kristalviolet-jodium complex niet weggewassen door de alcohol; deze cellen kleuren blauw-paars. Gram-negatieve cellen verliezen de eerste kleurstof weer door het alcoholbad; door de nakleuring met fuchsine kleuren ze daarna rood.
Het verschil in aankleuringsgedrag tussen Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën is gelegen in de samenstelling van de celwand. De Gram-negatieve bacteriën hebben namelijk een extra lipopolysacharidemembraan.
Dit lipopolysacharidemembraan is op te delen in 2 soorten:
- het kernlipopolysacharidemembraan
- het O-lipopolysacharidemembraan
Het kernlipopolysacharidemembraan zit dichter op de bacterie terwijl het O-lipopolysacharidemembraan de buitenste buitenkant is van elke gram negatieve bacterie
[bewerk] Uitvoering
- Markeer de bovenkant van een voorwerpglaasje met een krasstaafje
- Breng op een voorwerpglas met behulp van een entoog een druppel water; maximaal 8 druppels per glaasje.
- Suspendeer een zeer geringe hoeveelheid bacteriemateriaal in de druppel en strijk deze uit over het glas.
- laat drogen aan de lucht (of hoog boven de vlam).
- Fixeer door driemaal kort door de vlam te halen en laat afkoelen.
- Kleur het preparaat minstens 1 minuut met kristalvioletoplossing en spoel daarna voorzichtig met water
- Behandel met lugol (een oplossing van jodium in een kaliumjodideoplossing), 1 minuut.
- Giet de lugol af (niet spoelen) en ontkleur 20 seconden met 96% alcohol en spoel met water na.
- Kleur 1 minuut na met waterige fuchsine
- Spoel goed met water, vloei voorzichtig af tussen filtreerpapier en laat het preparaat drogen aan de lucht. Het kan dan onder de microscoop met olie-immersie worden bekeken (geen dekglaasje!).
De grampositieve bacteriën kleuren blauw, doordat het kristalviolet aangebracht op de bacterien niet meer via de dikke celwand naar buiten kan. De gramnegatieve bacteriën hebben een celwand met een fijne structuur waardoor het kristalviolet makelijk kan worden weggewassen. Door dat men fuchsine toevoegd zullen de gramnegatieve bacterien een rode kleur hebben.
Men bekijkt te preparaten met emersieolie meteen op een vergroting van 100x10 omdat de andere microscoop-lenzen niet tegen deze olie kunnen. Men dient ook de lens van 100x af te vegen na het bekijken van het prparaat.
