Apoptosi
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In biologia, il termine apoptosi (coniato nel 1972 da John F. Kerr, Andrew H. Wyllie e A. R. Currie a partire dal termine greco che indica la caduta delle foglie e dei petali dei fiori) indica una forma di morte cellulare programmata, termine con il quale il processo è anche chiamato. Si tratta di un processo ben distinto rispetto alla necrosi cellulare, che in condizioni normali contribuisce al mantenimento del numero di cellule di un sistema.
Al contrario della necrosi, che è una forma di morte cellulare risultante da un acuto stress o trauma cellulare, l’apoptosi è portata avanti in modo ordinato e regolato, richiede consumo di energia (ATP) e generalmente porta ad un vantaggio durante il ciclo vitale dell’organismo (è infatti chiamata da alcuni morte altruista o morte pulita). Durante il suo sviluppo, ad esempio, l’embrione umano presenta gli abbozzi di mani e piedi “palmati”: affinché le dita si differenzino, è necessario che le cellule che costituiscono le membrane interdigitali muoiano.
Dagli inizi degli anni ’90 la ricerca sull’apoptosi ha visto una crescita spettacolare. Oltre alla sua importanza come fenomeno biologico, ha acquisito un enorme valore medico, infatti processi difettosi di apoptosi riguardano numerose malattie. Una eccessiva attività apoptotica può causare disordini da perdita di cellule (si vedano ad esempio alcune malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson), mentre una apoptosi carente può implicare una crescita cellulare incontrollata, meccanismo alla base delle neoplasie.
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[modifica] Funzioni dell’apoptosi
[modifica] Nel danno cellulare e nell'infezione
L’apoptosi può avvenire quando una cellula è danneggiata oltre le proprie capacità di riparazione, oppure infettata da un virus. Il segnale apoptotico può venire dalla cellula stessa, dal tessuto circostante o da cellule del sistema immunitario.
Se la capacità apoptotica di una cellula è danneggiata (ad esempio a causa di una mutazione), oppure se è stata infettata da un virus in grado di bloccare efficacemente l’inizio della cascata apoptotica, la cellula danneggiata continuerà a dividersi senza limiti, trasformandosi in un cancro. Per esempio, il papillomavirus umano (HPV), esprime due oncogeni: E6 stimola la degradazione della proteina p53, che è una chiave fondamentale della linea apoptotica, attraverso un sistema proteolitico mediato da ubiquitina ed E7 si lega a Rb (gene soppressore tumorale) inibendola. In questo modo si ha lo sviluppo del carcinoma cervicale.
[modifica] Nella risposta allo stress o ai danni al DNA
Condizioni di stress, quali la mancanza di nutrienti, oppure il danneggiamento del DNA dovuto a molecole tossiche (es: idrocarburi policiclici) o all’esposizione a UV o radiazioni ionizzanti (raggi gamma e raggi X), possono indurre una cellula ad iniziare l’apoptosi.
[modifica] Nell’omeostasi cellulare
In un organismo adulto, il numero delle cellule contenute in un organo deve rimanere costante entro un certo margine. Le cellule del sangue e degli epiteli di rivestimento, ad esempio, sono costantemente rinnovate a partire dai loro progenitori staminali; ma la proliferazione è compensata da una costante morte cellulare.
In un organismo umano adulto attorno ai 50-70 miliardi di cellule muoiono ogni giorno a causa dei processi apoptotici. In un anno la massa delle cellule ricambiate è pari al peso del corpo stesso.
L’omeostasi è mantenuta quando la consistenza delle mitosi (proliferazione cellulare) in un tessuto è bilanciata dalla morte di un numero equivalente di cellule. Se questo equilibrio è disturbato si hanno due scenari:
- Se le cellule si dividono più velocemente di quanto muoiano, si sviluppa un tumore.
- Se le cellule muoiono più velocemente di quanto si dividano, si hanno disordini da perdita di cellule.
[modifica] Nello sviluppo
La morte cellulare programmata è parte essenziale dello sviluppo dei tessuti sia nelle piante che nei metazoi. Ricerche sugli embrioni di pollo – in particolare sullo sviluppo del tubo neurale – hanno suggerito come la proliferazione selettiva delle cellule, combinata con un’altrettanto selettiva apoptosi, disegni le architetture dei tessuti nei vertebrati durante lo sviluppo. Durante lo sviluppo dell’embrione di un vertebrato, le cellule della notocorda producono un gradiente di una molecola segnale detta Sonic hedgehog (Shh): questo gradiente dirige la formazione e lo sviluppo del tubo nerurale. Le cellule che ricevono Shh (attraverso il recettore di membrana Patched1 o Ptc1) sopravvivono e proliferano. In assenza di Shh, la parte intermebrana (carbossi-terminale) del medesimo recettore si lega alla caspasi-3, e tale legame fa sì che venga esposto un dominio pro-apoptotico [1] [2].
Così come nell’esempio precedente, le cellule di tutti i tessuti degli organismi multicellulari, dipendono dal continua disponibilità di segnali di sopravvivenza dall’ambiente extracellulare.
[modifica] Nella regolazione delle cellule del sistema immunitario
I recettori di membrana dei linfociti B e T immaturi non sono fatti su misura per coincidere con antigeni conosciuti. Al contrario, sono generati attraverso un processo altamente variabile che si esprime in una immensa varietà di recettori, capace di legarsi con uno stupefacente numero di forme molecolari. Ciò significa che la maggior parte di questi linfociti immaturi sono o inefficaci (dacché i loro recettori non legano alcun antigene con significato) oppure pericolosi per l’organismo medesimo, perché i loro recettori sono complementari a molecole normalmente presenti nell'organismo. Se questi linfociti fossero rilasciati senza ulteriori processi essi diventerebbero auto-immuni attaccando cellule sane dell’organismo. Per evitare tale scenario il sistema immunitario ha sviluppato un processo di eliminazione dei linfociti inefficaci o auto-tossici attraverso la via apoptotica.
Come abbiamo descritto nella precedente sezione sullo sviluppo, le cellule necessitano di un continuo stimolo alla sopravvivenza. Nel caso dei linfociti T, durante la loro maturazione nel timo, il segnale di sopravvivenza dipende dalla capacità di legare antigeni estranei. Quelli che falliscono il test, ossia circa il 97% dei neoprodotti, sono destinati a morire. I sopravvissuti sono sottoposti ad un ulteriore test di auto-tossicità, quelli che risultano altamente affini a molecole proprie dell’organismo vengono ugualmente avviati all’apoptosi.
[modifica] Il processo dell’apoptosi
[modifica] Segni morfologici
Una cellula in apoptosi mostra evidenti caratteristiche morfologiche individuabili al microscopio.
- La cellula diventa sferica e perde contatto con le cellule adiacenti. Questo avviene perché le proteine del citoscheletro vengono digerite da specifiche peptidasi (chiamate caspasi) che sono state attivate all’interno del citoplasma.
- La cromatina comincia ad essere degradata e condensata (il nucleo al microscopio risulta eterocromatico).
- La cromatina continua il processo di degradazione (in tipici frammenti lunghi 200 paia di basi circa) e condensazione in corpi addossati al nucleolemma. A questo punto la doppia membrana che confina il nucleo appare ancora completa; tuttavia, come ossrevano Kihlmark e colleghi[3], caspasi specializzate sono già ad uno stadio avanzato di degradazione delle proteine dei pori nucleari ed hanno iniziato la degradazione delle lamine, le proteine che “foderano” l’interno della membrana nucleare. Va notato che, mentre il primo stadio di condensazione della cromatina è stato osservato in cellule non apoptotiche, questo stadio avanzato (chiamato picnotico) è considerato preludio dell’apoptosi.
- Il nucleolemma diventa discontinuo e le molecole di DNA sono frammentate (il processo è definito carioressi. Il nucleo si rompe in alcuni “corpi cromatinici” o “unità nucleosomiali”.
- Il plasmalemma si rompe.
- La cellula è fagocitata oppure si divide in più vescicole, chiamate corpi apoptotici, che sono in seguito fagocitati.
[modifica] Segnali biochimici per una sicura eliminazione
La cellula morente che si avvia all’ultimo stadio dell’apoptosi, espone sulla membrana plasmatica dei segnali eat me (letteralmente, mangiami), come la fosfatidilserina. Normalmente la fosfatidilserina, fosfogliceride, si trova nello strato citosolico della membrana plasmatica, ma, durante l’apoptosi, è ridistribuita anche sulla faccia extracelluare da un’ipotetica (non ancora isolata) proteina detta scramblase (traducibile dall'inglese come l' enzima che mette in disordine). Fagociti necrofagi, come i macrofagi, hanno recettori specifici per la fosfatidilserina. La rimozione delle cellule morte è necessaria per prevenire la risposta infiammatoria[4] [5].
In studi sugli embrioni di topo privi di recettori per fosfatidilserina (PS) condotto da Ming O. Li e colleghi [6], le cellule andate in apoptosi e non fagocitate si sono accumulate nel cervello e nei nervi, risultando letali nel periodo neonatale. D’altra parte, un altro gruppo di ricercatori che ha eliminato il medesimo gene per recettore non ha trovato anomalie nella morte cellulare, così si è aperta la discussione se il gene realmente codifichi per il recettore PS piuttosto che codificare per un fattore di trascrizione localizzato nel nucleo [7].
In un altro studio Rikinari Hanayama e colleghi [8] hanno osservato che il fattore di crescita milk fat globule-EGF-factor 8 (MFG-E8) è legato alla fosfatidilserina sulle cellule apoptotiche e aiuta i macrofagi a fagocitarne i resti. I macrofagi contenenti corpuscoli del Fleming (i quali appaiono nei macrofagi che hanno fagocitato altre cellule) esprimono fortemente MFG-E8 sulla membrana. Topi mancanti di MFG-E8 dimostrano un calo nella capacità fagocitaria delle cellule apoptotiche, legato ad un estremo incremento della produzione di immunoglobuline IgG [9].
[modifica] Induttori intrinseci ed estrinseci
I messaggi pro-apoptotici provenienti dall’esterno della cellula (induttori estrinseci) saranno trattati nella sezione successiva.
Il messaggi pro-apoptotici provenienti dall’interno della cellula (induttori intrinseci) costituiscono una risposta allo stress, come la mancanza di nutrienti o un danno esteso al DNA.
Sia la via estrinseca che quella intrinseca hanno in comune l’attivazione degli effettori centrali dell’apoptosi, un gruppo di proteasi (specifiche per delle cisteine) chiamate caspasi, che dirigono la distruzione degli elementi strutturali (citoscheletro) e funzionali (organuli) della cellula.
[modifica] Processo biochimico
Le caspasi sono normalmente soppresse dalla proteina IAP (inibitrice dell’apoptosi) [10]. Quando una cellula riceve uno stimolo apoptotico, IAP è silenziata da SMAC (Secondo Attivatore Mitocondriale delle Caspasi) una proteina mitocondriale, che è rilasciata nel citosol. SMAC lega IAP, e legandosi "inibisce l’inibitore" che prima evitava di far iniziare la cascata apoptotica.
Prima di descrivere il rilascio di SMAC è però necessario osservare con attenzione due processi estrinseci molto studiati: le vie del TNF e del Fas.
Il Fattore di Necrosi Tumorale (TNF o Tumor Necrosis Factor), una proteina di 157 amminoacidi con funzione di segnale intercellulare (appartenente alla classe delle citochine), è prodotta principalmente dai macrofagi, ed è il principale mediatore estrinseco dell’apoptosi. La membrana cellulare ha due recettori specializzati per TNF: TNF-R1 e TNF-R2. Il legame del TNF al TNF-R1 è considerato l’innesco della via che attiva le caspasi [11].
Fas (o Apo-1 o CD95), è un’altro recettore dei segnali apoptotici estrinseci ed appartiene alla superfamiglia dei recettori TNF[12]. Il ligando di Fas (FasL o Fas Ligand) è una proteina transmembrana ed è parte della famiglia dei TNF. L’interazione ligando-recettore si risolve nella formazione di un complesso di segnalazione che induce la morte cellulare (DISC, da death-inducing signaling complex), che contiene la Fas-associated protein with death domains (abbreviata come FADD e recante domini, detti di morte, fondamentali per la cascata pro-apoptotica) e le caspasi 8 e 10. In alcuni tipi di cellula (tipo I), le caspasi-8 attive attivano direttamente numerose altre caspasi che portano all’apoptosi; in altri tipi di cellule (tipo II), Fas-DISC inizia un processo a feed-back che aumenta il rilascio di fattori pro-apoptosi dai mitocondri e amplificano l’attivazione delle caspasi-8.
A valle dell’attivazione di TNF-R1 e Fas – almeno nelle cellule dei mammiferi – il bilanciamento tra i membri pro-apoptotici (come BAX, BID, o BAD) e anti-apoptotici (Bcl-Xl e Bcl-2) della famiglia Bcl-2 viene compromesso. Tale equilibrio è regolato dalla formazione di omodimeri nella membrana esterna del mitocondrio. La formazione di omodimeri (di BAK o BAX) è necessaria per rendere permeabile la membrana mitocondriale esterna e rilasciare, così, l’attivatore delle caspasi. Non è ancora chiaro come BAK e BAX siano controllate dalla cellula non apoptotica; ma è stato ipotizzato che una proteina di membrana mitocondriale, VDAC2, interagisca con BAK inibendola. Quando è ricevuto un segnale, prodotti della cascata di attivazione – come tBID, BIM o BAD – rimpiazzano VDAC2, così che BAK e BAX possano attivarsi e la membrana mitocondriale diventi permeabile; si è notato che queste proteine (BAK e BAX) della famiglia delle Bcl-2 hanno domini formanti pori (che appunto rendono permeabile la membrana), che favoriscono il passaggio di membrana di molecole pro-apoptotiche come il citocromo c [13][14]. Anche altre molecole sono rilasciate dai mitocondri, come SMAC o AIF.
Una volta che è stato rilasciato il citocromo c, esso si lega ad Apaf-1 e ad ATP; in seguito si unisce ad una proteina pro-caspasi-9, creando un complesso multiproteico chiamato apoptosoma. L’apoptosoma stacca questa pro-caspasi, rendendo attiva la caspasi-9, la quale a sua volta attiva l’effettore caspasi-3.
L’intero processo richiede energia e una organizzazione cellulare non troppo danneggiata. Infatti se una cellula è danneggiata oltre un certo limite, non ha abbastanza “tempo” e “forze” di portare avanti il proceso dell’apoptosi, ma va in necrosi.
Va osservato, infine, che le vie apoptotiche riassunte precedentemente sono soggette a complessi meccanismi regolatori (quello che viene chiamato Cellular Signaling Network) e non c’è una relazione biunivoca tra la ricezione dei segnali TNF o FasL con un’esecuzione completa della via apoptotica. Fas, ad esempio, è anche implicata – paradossalmente – nella proliferazione cellulare, attraverso vie non ancora scoperte; e l’attivazione sia di Fas che di TNF-R1 (i recettori per le precedenti) portano anche all’attivazione di (NF-κB) (Fattore Nucleare kappa-B), che induce l’espressione di alcuni geni che giocano importanti ruoli in diversi processi biologici, inclusi proliferazione cellulare, morte cellulare, sviluppo cellulare e risposta immunitaria.
Il legame tra TNF e apoptosi dimostra il perché una produzione anormale di TNF giochi un ruolo fondamentale in varie malattie umane, specialmente (ma non solo) in quelle autoimmuni, come il diabete e la sclerosi multipla.
[modifica] Ruolo dell’apoptosi nelle patologie
[modifica] Apoptosi e progressione dell’HIV
In un articolo del 2004 di Alimonti e colleghi [15] si decrive come l’HIV-1 causi l’apoptosi dei linfociti T CD4+ portando allo sviluppo dell’AIDS.
[modifica] Apoptosi e ruolo degli interferoni nella soppressione tumorale
In un articolo del 2003, Takaoka e colleghi hanno descritto come gli interferoni-alfa e -beta (IFN-alfa/beta) inducano la trascrizione del gene p53, risultante in un incremento del livello di proteina p53 e l’inizio dell’apoptosi nelle cellule tumorali [16]. La proteina p53, infatti, è un soppressore tumorale, e va considerato come un fattore anti-crescita e anti-oncogenico.
Tale lavoro ha contribuito a chiarire il ruolo giocato dall’interferone nel guarire alcune forme umane di cancro e ha stabilito il legame tre p53 e interferoni. La risposta della p53, non solo contribuisce alla soppressione tumorale, ma è importante nel sostenere la risposta apoptotica anche nelle infezioni virali.
[modifica] Cancro e vie apoptotiche difettose
Liling Yang e colleghi riportano in un loro articolo del 2003 [17], il risultato del lavoro svolto riguardo il segnale di morte difettoso in un tipo di cancro delle cellule polmonari detto NCI-H460. Hanno trovato che la proteina XIAP (inibitrice dell’apoptosi X-linked) è sovraespressa nelle cellule H460. Le XIAP legano la forma attivata della caspasi-9, e sopprimono l’attività dell’attivatore apoptotico citocromo c. La via apoptotica è stata trovata altamente ripristinata nelle cellule H460 che presentavano un peptide Smac (SmacN7) che legano le IAP (proteine inibitrici l’apoptosi). Yang e colleghi hanno sviluppato con successo una SmacN7 sintetica che può selettivamente invertire la resistenza all’apoptosi – e dunque la crescita del tumore – nelle cellule H460 di topo.
[modifica] Ruolo dei prodotti apoptotici nell’immunità ai tumori
Un interessante caso di riutilizzo e feed-back dei prodotti dell’apoptosi è stato presentato da Matthew L. Albert in un articolo, con cui ha vinto l’ Amersham Biosciences & Science Prize for Young Scientists in Molecular Biology e pubblicato in Science Online nel dicembre del 2001 [18]. Egli descrive come le cellule dendritiche, un tipo di cellula che presenta l’antigene, fagocitino le cellule tumorali apoptotiche. Dopo la maturazione, queste cellule dendritiche presentano l’antigene (derivato dai corpi apoptotici fagocitati) ai linfociti T killer, che poi diventano specifici per distruggere le cellule che stanno subendo una trasformazione maligna. Questa via apoptosi-dipendente per l’attivazione dei linfociti T non è presente durante la necrosi ed ha aperto interessanti possibilità nella ricerca sull’immunità tumorale.
[modifica] Note
- ↑ Guerrero and Ruiz i Altaba, Longing for Ligand: Hedgehog, Patched, and Cell Death, Science 8 August 2003: 774-776, DOI: 10.1126/science.1088625
- ↑ Thibert et al, Inhibition of Neuroepithelial Patched-Induced Apoptosis by Sonic Hedgehog, Science 8 August 2003: 843-846, DOI: 10.1126/science.1085405
- ↑ Kihlmark, M.; Imreh, G.; Hallberg, E.; Journal of Cell Science 114 p. 3643, 2001 (PMID 11707516)
- ↑ Savill, J. et al., Science 302 p. 1516, 28 November 2003 (PMID 14645835)
- ↑ Wang, X. et al., Science 302 p. 1563, 28 November 2003 (PMID 14645848)
- ↑ Li, M.O. et al., Science 302 p. 1560, 28 November 2003 (PMID 14645847)
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- ↑ Takaoka, Akinori, et al., Integration of interferon-alpha/beta signaling to p53 responses, Nature 424 p. 517, 31 July 2003 (PMID 12872134)
- ↑ Yang L et al, Predominant suppression of apoptosome by inhibitor of apoptosis protein in non-small cell lung cancer H460 cells: therapeutic effect of a novel polyarginine-conjugated Smac peptide, Cancer Res. 2003 Feb 15;63(4):831-7
- ↑ Albert, M.L., Science Online, 21 December 2001
[modifica] Bibliografia e risorse elettroniche (inglese)
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