Фарбування за Грамом

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.

Грам-позитивні бактерії сибірської виразки (фіолетові палички) в зразку мозко-спінної рідини. Грам-негативні бакрерії були б рожерого коліру. Інші клітини — білі кров'яні тільця)

Фарбування за Грамом (або метод Грама) — емпірічно виведений метод розрізнення бактерій за допомогою фарбування їх певним методом на дві великі групи: Грам-позитивні і Грам-негативні), що розрізняються хімічними та фізичними властивостями їх клітинної стінки.

Метод називається на честь його винахідника, данського ученого Ганса Хрістіана Грама (1853—1938), який розробив цей метод у 1884 році щоб розрізнити бактерії Pneumococcus і Klebsiella pneumoniae.

[ред.] Використання

Фарбування за Грамом — одна з найкорисніших фарбувальних процедур у лабораторних дослідженнях в мікробіології. Процедура широко використовується як інструмент для для розрізнення Грам-негативних і Грам-позитивних бактерій, що звичайно є першим кроком у визначенні ідентичності специфічного бактерійного зразка.

У медицині фарбування за Грамом виконується при аналізі крові або біопсії, коли підозрюється інфекція. Цей метод набагато швидший, ніж культура, і особливо важливий, коли тип інфекції необхіден для прогнозу та вибору методу лікування. Наприклад, при діагностиці цереброспінальної рідини на менінгіт і рідини суглобів на септичний артрит.

При аналізі, наприклад, Коки і спороносні форми бактерій, а також дріжджи — грам-позитивні і забарвлюються в синяво-чорний (темно-синій) колір, більшость з решти бактерій — грам-негативні і забарвлюються в червоний колір, ядра клітин еукаріот набувають яскраво-червоного кольору, а цитоплазма — рожевого.

[ред.] Техніка проведення фарбування

Фарбування за Грамом відноситься до складного способу фарбування, коли на мазок впливають двома фарбниками, з яких один є основним, а інший — додатковим. Окрім фарбувальних речовин при складних способах забарвлення застосовують обезбарвлюючі речовини: спирт, кислоти та ін. Для фарбування по Граму частіше використовують фарбники тріфенілметанової групи: генциановий, метиловий фіолетовий або крісталлвіолет. Грам-позитивні (Грам (+)) мікроорганізми дають міцне з'єднання з вказаними фарбниками і йодом. При цьому вони не обезбарвлюються при дії на них спиртом, унаслідок чого при додатковому забарвленні фуксином Грам (+) мікроорганізми не змінюють спочатку прийнятий фіолетовий колір.

Грам-негативні (Грам (-)) мікроорганізми утворюють з основними фарбниками і йодом з'єднання, що легко руйнується під дією спирту. В результаті мікроби обезбарвлюються, і потім забарвлюються фуксином, набуваючи червоного кольору

[ред.] Підготовка матеріалу для фарбування

Досліджуваний матеріал розподіляють тонким шаром по поверхні добре знежиреного скла. Приготований мазок висушують на повітрі і після повного висихання фіксують.

[ред.] Фіксація

При фіксації мазок закріплюється на поверхні скла, і тому при подальшому фарбуванні препарату мікробні клітки не змиваються. Крім того, убиті мікробні клітки забарвлюються краще, ніж живі. Розрізняють фізичний спосіб фіксації, в основу якого покладена дія високої температури на мікробну клітку, і хімічні способи, що передбачають застосування хімічних засобів, зухвалих коагуляцію білків цитоплазми.

Фізичний спосіб фіксації: Скло з препаратом беруть пінцетом і плавним рухом проводять 2-3 рази над верхньою частиною полум'я пальника. Важ процес фіксації повинен займати не більш 2 с. Надійність фіксації перевіряють наступним прийомом: вільну від мазка поверхню скла прикладають до тильної поверхні лівої кисті. При правильній фіксації мазка скло повинне бути гарячим, але не викликати відчуття опіку (70—80 °С).

Хімічний спосіб фіксації: Для фіксації мазків застосовують метиловий спирт, ацетон, суміш Никіфорова (суміш етилового спирту 96 % і наркозного ефіру в співвідношенні 1:1), рідина Карнуа (етилового спирту 96 % — 60 %, хлороформу 30 %, крижаної оцетової кислоти 10 %). Скло з висушеним мазком занурюють в склянку з фіксуючою речовиною на 10-15 хвилин і потім висушують на повітрі.

[ред.] Процес фарбування

1. На фіксований мазок наливають один з основних фарбників на 2—3 хвилини. Щоб уникнути опадів офарблюють через фільтрувальний папір.
2. Зливають фарбу, акуратно видаляють фільтрувальний папір. Мазок заливають на 1—2 мін розчином Люголя або йодистим розчином по Граму (водний розчин йодиду калія і кристалічного йода в співвідношенні 2:1) на 1—2 хвилини до почорніння препарату.
3. Розчин зливають, мазок прополіскують 96° етиловим спиртом або ацетоном, наливаючи і зливаючи його, поки і мазок не обезбарвиться і стікаюча рідина не стане чистою (приблизно 20-40-60 секунд).
4. Ретельно промивають стекла в проточній або дистилюючій воді 1—2 мин.
5. Для виявлення грам-негативних бактерій препарати додатково офарблюють фуксином або сафраніном (2—5 мін).
6. Промивають в проточній воді і висушують фільтрувальним папером.

[ред.] Посилання

• GramHC (1884). "Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten". Fortschritte der Medizin 2: 185-89.
• Bergey, David H. (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
• Madigan, MT (2004). Brock Biology of Microorganisms.
• Ryan, KJ (2004). Sherris Medical Microbiology.
• Application of stains in clinical microbiology — резюме статьи в Biotechnic & Histochemistry, Volume 76, Number 3, May 01, 2001, pp. 119—125(7)