Метод Грама
Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Грама метод окраски микроорганизмов для исследования предложен в 1884 датским врачом Х. К. Грамом (Нans Christian Gram).
Метод позволяет дифференциировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. По Граму бактерии окрашивают основными красителями — генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором иода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными, называют грамположительными бактериями (обозначаются Грам (+)), — в отличие от грамотрицательных (Грам (—)), которые обесцвечиваются при промывке.
Содержание |
[править] Использование в диагностике
Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.
Кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей — грамположительны и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, многие неспороносные бактерии — грамотрицательны и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма — розовый.
[править] Техника проведения окраски
Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.
Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.
Грамотрицательные Грам (-) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
[править] Подготовка материала для окраски
Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.
[править] Фиксация
При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.
Физический способ фиксации:
Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2с.
Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70—80 °С).
Химический способ фиксации:
Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.
[править] Процесс окрашивания
- На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2—3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
- Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1—2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1—2 минуты до почернения препарата.
- Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока и мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).
- Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин.
- Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин).
- Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.
[править] См. также
- Окрашивание микроорганизмов
[править] Ссылки
[править] На английском языке
- Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten // Fortschritte der Medizin. — 1884. — Т. 2. — С. 185-89.
- David H. Bergey Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. — 9th ed.. — Lippincott Williams & Wilkins, 1994. ISBN �1�
- MT Madigan Brock Biology of Microorganisms. — 10th Edition. — Lippincott Williams & Wilkins, 2004. ISBN �2�
- KJ Ryan Sherris Medical Microbiology. — 4th ed.. — McGraw Hill., 2004. ISBN �3�
- Application of stains in clinical microbiology — резюме статьи в Biotechnic & Histochemistry, Volume 76, Number 3, May 01, 2001, pp. 119—125(7)
