Polymerase-kettingreactie
De polymerase-kettingreactie, vaak afgekort tot PCR (van Polymerase Chain Reaction), is een manier om uit zeer kleine hoeveelheden DNA (enkele moleculen) specifiek een of meer gedeeltes te vermenigvuldigen (amplificeren) tot er genoeg van is om het te analyseren.
Volgens conventionele methoden kan men wel korte stukjes DNA, bijvoorbeeld 10 of 12 basen, synthetiseren, maar voor langere stukken zijn de chemische reacties die daarvoor worden gebruikt niet specifiek genoeg: er worden bij langere en langere stukken steeds meer foute sequenties gevonden.
De Polymerase-kettingreactie kan dit probleem oplossen door een natuurlijk eiwit te gebruiken dat ervoor zorgt dat een DNA streng met een zeer hoge kwaliteit wordt gemaakt. Dit is echter niet zo heel eenvoudig want:
- Om een stuk DNA te bouwen, gebruikt dat eiwit een voorbeeld-DNA. Dat moet er dus wel eerst zijn.
- Het eiwit heeft een klein beginnetje nodig.
Voor het eerste probleem grijpt men afhankelijk van de toepassing naar verschillende methoden:
- Een bioloog of biochemicus wil vaak een stuk DNA van een bestaand organisme multipliceren (of iets wat er sterk op lijkt). Het origineel kan als voorbeeld dienen.
- Bij een forensisch onderzoek vindt men het voorbeeld (bijvoorbeeld een bloedvlek) op de plaats van een misdrijf.
- Bij onderzoek naar de authenticiteit van levensmiddelen wordt de techniek toegepast om de aanwezigheid van genetisch gemanipuleerde organismen (GGO) aan te tonen.
Het kleine beginnetje kan men volgens de traditionele methode maken, als men tenminste weet waar de gewenste DNA sequentie mee begint en waarmee hij eindigt. Deze stukjes noemt men primers.
Inhoud |
[bewerk] Werking van de reactie
De reactie bestaat uit drie fasen:
- Denaturatie: gedurende deze fase wordt al het DNA dat als dimeer in de oplossing aanwezig is gesplitst door een verhoogde temperatuur: de dubbele helix valt uit elkaar.
- Hybridisatie: het grote, logge, voorbeeld-DNA krijgt bij lage temperatuur even de tijd om met de snel mobiele primers in de oplossing te hybridiseren. Het krijgt niet genoeg tijd om de denaturatie ongedaan te maken.
- Extensie: het polymerase zet de gebonden primers bij gemiddeld hoge temperatuur om in het gewenste stuk DNA.
Na de derde stap bevat de oplossing twee maal zoveel van het gewenste DNA als ervoor. Door de stappen een aantal malen (bijvoorbeeld 30) te herhalen, krijgt men een exponentiele groei van de hoeveelheid gewenst DNA.
Omdat het polymerase alleen richting de doelsequentie kopieert, wordt dit stukje exponentieel gekopieerd, terwijl ander DNA al bij de derde cyclus niet meer gekopieerd wordt. Hierdoor zijn er na dertig cycli miljarden kopieën van de doelsequentie en nog steeds maar een heel klein beetje ander DNA.
Het DNA-polymerase van (de bacterie) Thermus aquaticus die in heetwaterbronnen en geisers leeft wordt gebruikt omwille van de thermostabiliteit. Tijdens de verschillende cycli van een PCR-reactie worden namelijk herhaaldelijk temperaturen bereikt die polymerasen van gewone kiemen denatureren. Een primer is een klein stukje enkelstrengs DNA dat gebruikt wordt als startpunt van de PCR (polymerase ketting reactie). Er zijn steeds twee primers nodig, één voor de 5'-streng en één voor de 3'-streng.
De beste primer voor PCR is een korte RNA-streng. Deze streng wordt kunstmatig gemaakt met een RNA polymerase. De RNA-streng wordt dan door DNA polymerase omgezet in een korte enkelstrengs DNA. Deze DNA-streng is zo kort dat het zich vanzelf aan een ander complementair stuk enkelstrengs DNA hecht en zo het startpunt vormt voor de replicatie.
Vanaf de primer wordt het DNA richting 5' gekopieerd.
[bewerk] Schematisch
- Door de DNA te verhitten tot tussen de 90 en 96°C gaan de twee strengen uit elkaar (denaturatie)en ontstaan 2 matrijsen.
- Vervolgens hechten de primers zich bij een temperatuur tussen de 45 en 65°C door de langzaam dalende temperatuur aan de twee enkelvoudige DNA-strengen.
- Bij 72°C wordt door DNA polymerase de primer richting 5' verlengd, waardoor er twee stukken dubbele DNA-strengen ontstaan.
- Nu worden deze stukjes weer door verhitting gesplitst in enkelstrengs DNA enz. Daar de aanwezige primers voorkeursparing hebben met de twee enkelstrengs DNA die een verlenging zijn van deze primers worden alleen deze DNA stukken gerepliceerd. Na enkele cycli is er zoveel DNA aangemaakt dat deze aangetoond kan worden met gelelektroforese.
[bewerk] Praktisch
Een mengsel van DNA-monster, DNA polymerase, twee specifieke primers (5' en 3'), dNTP's (een algemene term voor de vier deoxyribonucleotides: dATP, dCTP, dGTP en dTTP ook wel oligonucleotiden genoemd), een buffer en magnesiumchloride. Er wordt gebruikgemaakt van een thermostabiel Polymerase-enzym, zoals Taq-polymerase, wat een optimumtemperatuur van ongeveer 72 graden heeft. De buffer zorgt voor een optimale pH en zoutconcentratie. Magnesiumchloride is een katalysator voor de binding tussen DNA Polymerase, DNA en NTP waarmee de snelheid van het proces tegenover de nauwkeurigheid kan worden uitgebalanceerd.
De rest van het proces is een kwestie van goed getimede temperatuursveranderingen. Als voorbeeld de procedure voor menselijk DNA met Taq Polymerase:
- De denaturatiefase wordt uitgevoerd bij 94°C, hierbij worden de beide DNA-strengen gescheiden
- De hybridisatie bij 45-65°C, annealing van de oligonucleotiden en primers
- Voor de extensie wordt de temperatuur weer opgevoerd tot 72°C, waarbij de oligonucleotiden dienen als primer voor de taq-polymerase
Hierna wordt het proces 30-40 keer herhaald.
[bewerk] Real time PCR
Bij de real time PCR methode kan tijdens de PCR het DNA al worden aangetoond en is een snelle methode voor het opsporen van micro-organismen. De primers hebben een label dat zichtbaar wordt als bij gebruik van de primer het label vrijkomt. Het vrij gekomen label gaat licht van een bepaalde golflengte uitzenden. Hoe meer DNA wordt omgezet des te sterker het signaal, dat grafisch wordt uitgezet. Uit de grafiek wordt de hoeveelheid DNA berekend.
[bewerk] PCR-ELISA
De PCR-ELISA test is een goedkoper alternatief van de Real time PCR methode.
[bewerk] Geschiedenis en gebruik
De reactie is bedacht in 1983 door Kary Mullis. Hij wordt o.a. gebruikt bij het aantonen en analyseren van kleine aantallen bacteriën en virussen, en bij het opwerken van sporen sperma of andere lichaamscellen (haarwortels, bloedcellen) door daders bij misdaden op het slachtoffer achtergelaten.
Vervuiling van gewassen met ggo stuifmeel kan momenteel (2005) gedetecteerd worden met een gevoeligheid van 1 op 20.000 ofwel 0,005%. Rond 2000 was de detectie-limiet nog 1,0-0,1%.
