ELISA
ELISA is een acroniem voor een laboratoriumtest voor het meten van groot-moleculaire stoffen zoals eiwitten in bijvoorbeeld bloedmonsters. De naam is een afkorting van Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay. ELISA is een immunochemische reactie en alle immunochemische bepalingen zijn gebaseerd op hetzelfde principe, de specifieke binding tussen antigen en antistof.
Inhoud |
[bewerk] Detectie
Het opsporen gebeurt door binding van de eiwitten met antilichamen die gelabeld zijn. Dit wil zeggen dat ze chemisch gekoppeld worden aan een enzym zoals peroxidase dat via een of meer tussenstappen een kleurstof doet ontstaan; Hoe meer van de te detecteren stof aanwezig was, hoe meer enzymwerking gebonden wordt en hoe meer kleurstof er uiteindelijk ontstaat.
[bewerk] Protocol
- Het monster wordt opgebracht op een onderlaag (plastic plaatje dat eiwitten adsorbeert)
- Er wordt geblokkeerd met eiwit (BSA) om niet-specifieke binding van de antilichamen tegen te gaan.
- Spoel de plaat met bufferoplossing vrij van ongebonden monster
- Voeg het antilichaam toe
- Spoel de ongebonden antilichamen weg
- Als er twee antilichamen gebruikt worden:
- Spoel met BSA (of koemelk) zodat aspecifieke bindingen van het tweede antilichaam veel minder waarschijnlijk worden
- Voeg het tweede antilichaam toe.
- Spoel de plaat, zodat niet-gebonden antistoffen verdwijnen
- Voeg een chemische stof (TMB) toe die met het gebonden enzym reageert tot een meetbaar reactieproduct, bijvoorbeeld een kleurstof.
- Meet de concentratie van het reactieproduct; deze is dan een maat voor de hoeveelheid aanwezige eiwitten.
Hoe gaat ELISA in zijn werk 1 Als eerst heb je een plaat nodig waar je je monsters in gaat pipeteren. Deze plaat kan al gecoat(de antistoffen of antigenen op de bodem van het welletje) aangelverd worden of zefl gemaakt worden. Na het coaten kan je de plaat eventueel blokken als je te maken hebt met een erg geveolige reactie. Het blokken van een plaat doe je om a-specifieke reacties te voorkomen. 2 Na het teoveogen van het monster wordt de plaat geincubeerd. Ook kan je nog Assay buffer toeveogen als je je welletje wil verdunenn. 3 na het incuberen moet de plaat eerst gewassen worden om al het overtollige niet gebonden monster weg te spoelen. 4 Na het wassen wordt het enzym conjugaat toegevoegd. Het conjugaat is een voorebreidende stap op kleuren. Aan het conjugaat zit een label van peroxidase. Na het toevoegen van het conjugaat wordt de plaat weer gewassen. 5 Na het incuberen van het conjugaat wordt de palat weer gewassen en wordt het substraat teogevoegd. Het substraat ook wel TMB genoemd regeert met het conjugaat wat eerder is toegevoegd. Door toevoeging van substraat onstaat er een Oxidatie reactie tussen het TMB en de peroxidase van het conjugaat. Hierdoor ontstaat er een blauwe kleur. 6 Nu wordt er weer geincubeerd. Na een korte incubatie gestopt met stopoplossing. Deze stopt de enzym met reageren en er ontstaat een gele kleur. 7 Nu is de plaat klaar om gelezen te worden.
[bewerk] Variaties
Er kan gebruikgemaakt worden van twee verschillende antilichamen (secundaire detectie):
- Een ongemerkt antilichaam voor de stof die gemeten moet worden.
- Een gelabeld antilichaam tegen het constante gedeelte het eerste antilichaam. ("Constant" slaat hier op een gedeelte van de "zware keten" die elk antilichaam van dat type (bijvoorbeeld IgG) gemeen heeft.
Het eerste antilichaam kan bijvoorbeeld afkomstig zijn van een konijn waarbij een immuunreactie is opgewekt tegen de gezochte stof (door boostervaccinatie met die stof). Het tweede antilichaam is afkomstig van een ander dier (bijvoorbeeld een ezel). Het gebruik van meerdere antilichamen levert aanzienlijke voordelen op:
- Signaalversterking: Per eerste antilichaam kunnen meerdere tweede antilichamen binden.
- Schaalvergroting: Het tweede antilichaam hoeft alleen maar specifiek tegen de donor van het eerste te zijn, niet zozeer tegen een bepaalde stof, waardoor productie veel grootschaliger en goedkoper kan.
[bewerk] IJking
Om de hoeveelheid te bepalen worden van tevoren verdunningen met bekende concentraties van de te meten stof gemaakt en tevens verdunningen van het monster. Omdat de hoeveelheid signaal evenredig is met de hoeveelheid enzym, kan bepaald worden wat de concentratie in het monster is. Een voorbeeld is de dopingtest: door concentraties te meten en te vergelijken met de toegestane (van nature aanwezige) concentraties, wordt een atleet gecontroleerd op doping.
[bewerk] Bepaling
Als de plaat gekleurd is, is de plaat klaar om gelezen te worden. Dit gebeurt met een ELISA reader. Dit gebeurt op basis van een spectrofotometrische bepaling. Bij deze bepaling wordt gebruikt gemaakt van twee golflengtes zodat de bepaling nauwkeuriger is. Bij een hogere golflengte hebben sterke kleuringen namelijk geen invloed. Er bestaat ook een PCR-ELISA test.
