ELISA
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ELISA è l'acronimo dell'espressione inglese Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne è probabilmente affetto.
ELISA trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di anticorpi nel plasma sanguigno, come ad esempio nei test per l'AIDS.
Una variante del test, chiamata DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich), si compone di più fasi che in sintesi prevedono:
- Immissione di una soluzione dell'anticorpo primario, specifico per l'antigene da individuare, nei pozzetti di una apposita piastra da saggio e lavaggio con soluzione tampone; L'anticorpo primario aderisce al fondo dei pozzetti e l'eccesso viene lavato via.
- Aggiunta, in soluzioni con diverse concentrazioni, dei campioni dei quali bisogna saggiare la presenza, o meno, dell'antigene caratteristico dell’organismo patogeno e lavaggio con soluzione tampone; L'antigene, se presente, si lega specificamente con l'anticorpo e l'eccesso viene lavato via.
- Aggiunta dell'anticorpo secondario, coniugato con un enzima (da cui il nome del test), tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina, e lavaggio con soluzione tampone; L'anticorpo secondario si lega selettivamente all'antigene, se presente, e l'eccesso viene lavato via. L’assenza dell’antigene specifico per l’anticorpo comporta che l’anticorpo secondario (e il relativo enzima ad esso coniugato), con il lavaggio, venga dilavato.
- Aggiunta di p-nitrofenilfosfato; Questa sostanza provoca una reazione con l'enzima coniugato all'anticorpo secondario producendo p-nitrofenolo di colore giallo. Se l’antigene caratteristico dell’organismo patogeno è assente nel pozzetto non vi sarà neanche l’enzima coniugato all’anticorpo secondario - la reazione non può avvenire.
- Aggiunta di idrossido di sodio per bloccare la reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato;
- Lettura del risultato, espressione della reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato che produce sul substrato una reazione cromogenica o fluorogenica - ovvero sviluppo di colore o luce di fluorescenza - successivamente misurabile.
Lo sviluppo del colore è indicativo della presenza dell'antigene che si voleva saggiare e l'intensità della colorazione, misurabile grazie al spettrofotometro, è semi-quantitativa secondo una scala arbitraria di intensità.
Il test è da intendersi valido se la reazione risulta positiva nel pozzetto di controllo dove è sicuramente presente l'antigene e negativa nel pozzetto di controllo dove l'antigene sicuramente non è presente.
