Western blot
Un article de Wikipédia, l'encyclopédie libre.
Vous avez de Un Western blot est un test utilisant une méthode de protéomique pour détecter une protéine spécifique dans un échantillon à l'aide d'un anticorps spécifique de cette protéine.
Cette technique fournit également des informations sur la taille de cette protéine. Son nom est un calembour de la technique Southern blot, technique pour la détection d'ADN développée plus tôt par Edwin Southern. La détection d'ARN étant appelé northern blot.
Sommaire |
[modifier] Électrophorèse
La première étape est l'électrophorèse sur gel. Les protéines de l'échantillon sont séparées selon la taille sur un gel, habituellement du SDS-JC-PAGES (Voir médecine à Tours). Généralement le gel possède plusieurs puits, de sorte qu'il est possible d'analyser plusieurs échantillons simultanément. Cependant, il est également possible d'employer un gel 2-D qui permet de faire migrer les échantillons dans deux dimensions.
[modifier] Transfert sur membrane
Les protéines dans le gel sont alors transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF, par pression ou par application d'un courant électrique. Ce processus est nécessaire puisqu'il permet d'exposer les protéines à l'anticorps (voir ci-dessous). La membrane est "collante" et lie des protéines non-specifiquement (c.-à-d. qu'elle lie toutes les protéines présentes dans l'échantillon). Les protéines vont se fixer à la membrane grâce à des interactions hydrophobes et ioniques. Les membranes de PVDF sont souvent employées du fait de leur solidité, de plus elles peuvent être nettoyées et réutilisées. À la différence de celles en nitrocellulose, les membrane de PVDF doivent être imbibées de méthanol ou isopropanol à 100% avant leur utilisation.
[modifier] Blocage
Le blocage de la membrane permet de saturer les sites d'interactions non spécifiques entre la membrane et les anticorps (étape suivante, ci-dessous). Il consiste à plonger la membrane dans une solution de BSA ou de lait en poudre sans matières grasses. Sans blocage, les anticorps appliqués lors de l'étape suivante se fixeraient partout sur la nitrocellulose.
Généralement, la saturation de la membrane se fait dans le lait dilué à 5% (5 g pour 100 ml), pendant une heure à température ambiante.
[modifier] Anticorps primaire
Le premier anticorps (souvent appelé anticorps primaire) est incubé avec la membrane. Il est dilué dans une solution contenant une faible quantité de sel tel que le chlorure de sodium, quelques protéines (telle que la BSA) pour empêcher les fixations non spécifiques de l'anticorps sur la membrane et dans un tampon afin de garder la solution proche d'un pH neutre.
La solution diluée d'anticorps et la membrane peuvent être scellées dans un sachet en plastique et être doucement agitées pour une "incubation" d'environ une demi-heure. L'anticorps primaire ne reconnaît et ne va se fixer que sur la protéine étudiée.
Cet anticorps primaire est obtenu en immunisant un animal (habituellement un lapin ou une chèvre) avec la protéine étudiée (c'est-à-dire, en injectant la protéine dans le corps de l'animal). On prélève ensuite les anticorps que l'animal a produit contre cette protéine. Quelques anticorps monoclonaux dont l'affinité est plus élevée peuvent également être utilisés en western blot.
Les protéines, lors de l'éléctrophorèse SDS-PAGES, on été dénaturés. Il faut donc utiliser des anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine dénaturée. La reconnaissance de protéines par des anticorps in vitro répond en effet à des contraintes conformationelles des protéines. Un anticorps qui reconnait une protéine donnée ne va pas forcément reconnaitre la même protéine dénaturée
[modifier] Anticorps secondaire
La membrane va ensuite être rincée afin d'enlever les anticorps primaires non liés, puis des anticorps secondaires vont être incubés avec la membrane.
Ces anticorps vont se lier aux premiers anticorps (ils sont habituellement produits par un animal différent). Cet anticorps secondaire est habituellement lié à une enzyme qui permet l'identification visuelle de la protéine étudiée sur la membrane. Comme pour les techniques ELISPOT et ELISA, lorsque l'on va rajouter le substrat adapté à l'enzyme, il va en résulter une réaction coloré qui sera visible sur la membrane.
Une alternative à l'utilisation d'enzyme couplée à un anticorps secondaire est d'utiliser une "étiquette" radioactive. Une protéine anticorps telle que la protéine A du staphylocoque peut être utilisée et marquée avec un isotope radioactif de l'iode.
[modifier] Résultat
Les anticorps secondaires non liés sont enlevés, et le substrat de l'enzyme est incubé avec la membrane. Si une étiquette radioactive a été utilisée, un film radiographique va être posé sur la membrane. Les bandes correspondant à la protéine étudiée apparaîtront sur le film développé (par des régions plus foncées).
Ainsi, le premier anticorps identifie spécifiquement la protéine étudiée, et le deuxième anticorps identifie spécifiquement le premier anticorps, une "tache" apparaissant sur la membrane caractérisera donc la position de la protéine étudiée.
Des approximations de taille peuvent être faites en comparant les bandes obtenues à celle d'un marqueur de taille. Habituellement, le gel n'est pas complètement exempt de protéines après avoir épongé.
En principe, il serait possible de lier le signal chimique directement au premier anticorps, mais la production des anticorps est plus facile si les deux fonctions de reconnaissance spécifique et de signalisation sont séparées. De plus, le signal est plus puissant en utilisant des anticorps secondaires, deux anticorps secondaires pouvant se fixer à un même anticorps primaire (Le signal est donc en principe deux fois plus puissant.
[modifier] Applications médicales
|
|
|
