Denaturacja DNA

Z Wikipedii

Denaturacja DNA zwana także "topieniem DNA" polega na separacji podwójnej nici DNA na dwie pojedyncze nici wskutek zerwania więzi wodorowych pomiędzy nićmi.

Dwuniciowa helikalna struktura DNA jest względnie stabilna dzięki wiązaniom wodorowym między zasadami oraz oddziaływaniu nakładających się zasad. Dodatkowo helisa ulega solwatacji, powodującej wytwarzanie się powłoki hydratacyjnej z cząsteczek wody wokół DNA. Oddziaływania te trzeba przezwyciężyć, jeżeli chce się przeprowadzić proces topnienia DNA lub jego denaturacji.

Dwie nici DNA ulegają wyraźnemu rozdzieleniu po inkubacji w roztworach o pH>12 i pH<2, ze względu na jonizację zasad. Jonizacja przynosi w efekcie zmianę właściwości tworzenia wiązań wodorowych przez zasady, która prowadzi do zaburzenia normalnych wiązań wodorowych typu Watsona-Cricka między A i T oraz C i G. Dodatkowo przy bardzo wysokim lub niskim pH powłoka hydratacyjna otaczająca cząsteczkę DNA ulega zaburzeniu, powodując destabilizację nakładania się par zasad. Traktowanie DNA kwasem prowadzi do depurynacji i depirymidyzacji- utraty zasad przez trawienie wiązania glikozydowego. Wiązanie fosfodiestrowe w miejscach pozbawionych zasad staje się bardziej podatne na hydrolizę, wobec tego silne kwasy wywołują degradację DNA. Ze względu na to, że pojedyncze nici DNA są stosunkowo stabilne w środowisku alkalicznym, denaturację przeprowadza się zazwyczaj właśnie w takich warunkach.

Wzrost temperatury DNA powoduje destabilizację podwójnej helisy, wywołuje rozdzielenie nici. Ciepło zaburza zarówno wiązania wodorowe jak i powłokę hydratacyjną, prowadząc do zmniejszenia sił utrzymujących obie nici razem. Eksperymentalnie stwierdzono liniową zależność między zawartością G+C a temperaturą topnienia DNA. Temperaturę, w której 50% składu próbki DNA ulega denaturacji, nazywa się temperaturą topnienia, Tm.

Denaturację DNA można oceniać na wiele sposobów. Jedną z metod jest pomiar charakterystycznego wzrostu absorbancji przy 260nm, zwanego efektem hiperchromowym, a pochodzącego od zaburzenia nakładania się zasad. Inne metody polegają na zastosowaniu enzymów specyficznych dla jednoniciowego DNA, takich jak nukleaza S1. Szybka zmiana warunków, taka jak gwałtowne ochłodzenie próbki DNA po denaturacji termicznej, powoduje przejście rozdzielonych nici w nieuporządkowaną strukturę solenoidu. W tej konformacji 2 nici nie mogą na powrót utworzyć podwójnej helisy. Jednak jeżeli DNA ochładza się powoli, to małe komplementarne obszary przeciwnych nici DNA mogą się łączyć, dając krótkie obszary podwójnej helisy. Po takiej inicjacji pozostała część helisy szybko ulega renaturacji.