光学顕微鏡

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光学顕微鏡の模式図 1：接眼レンズ、2：レボルバ（転換器）、3：対物レンズ、4：粗調整ノブ、5：微調整ノブ、6：ステージ（プレパラートなどを保持する）、7：鏡、8：絞り

双眼実体顕微鏡
（オリンパスのSZIII）

光学顕微鏡（こうがくけんびきょう）は、可視光線と、その近辺の波長域の光を利用する、顕微鏡の一種。単に顕微鏡と言う場合、これを指す。

[編集] 概要

光学顕微鏡は、試料に自然光やレーザーなどを照射し、透過光や反射光、その他試料が発する光を光学系で拾って像を拡大し、観察する。観察可能な倍率は一般に数十倍～数百倍、最高で2千倍程度。

顕微鏡技術のことを顕微鏡法(microscopy)、検鏡法という。また、試料を顕微鏡で観察できる状態にしたものをプレパラートという。

顕微鏡の類の中では最初に開発されたもので、単一のレンズによる観察法の拡張として開発されたものである。16世紀末オランダのヤンセン親子（Hans ＆ Zacharias Jansens）が発明したといわれる。同じくオランダのレーウェンフックも独自の顕微鏡で様々な生物学的発見をしたことで知られるが、彼のそれは単一のレンズを持つもので、むしろ高度な虫眼鏡という方が分かりやすい。

[編集] 基本構成

上図のような構造のものは、学校教育の場でしか見掛けない。研究に用いられるものは何らかのランプを備えており、照明関係やその制御に伴う電源装置が装備されている。

光源:種々のランプや反射板。
コンデンサー:光源の光を試料の観察点へ収束させる。
ステージ:プレパラートを固定する台。
対物レンズ:試料からの光を集光する。
接眼レンズ:対物レンズからの光を目やカメラに結像させる。
鏡筒:対物レンズ～接眼レンズの光路を確保する筒。

[編集] 光路の配置による分類

対物レンズから入った光を途中で分割し、左右の接眼レンズに振り分けるタイプの顕微鏡は双眼顕微鏡（binocular microscope）と呼ばれる。また、プレパラートの下側から光をあてて上側の対物レンズで像を拾うタイプの顕微鏡を正立顕微鏡、逆に対物レンズがプレパラートの下側に位置するタイプを倒立顕微鏡（inverted microscope）という。倒立顕微鏡には、培養細胞を培養容器ごと観察できるなどの利点がある。

[編集] 可視光線の利点と制約

光学顕微鏡は、観察したい物体の光の透過率など、物体が光に及ぼすさまざまな効果を利用するものである。可視光線を使う利点は、他の電磁波よりも簡素な光源（反射鏡はその最たる例である）を用いる事ができる点、そして元々可視的である為に、観察者の眼に届く前に可視光へ変換する必要が無い点である。

しかし一方で、光学顕微鏡の性能は光の物理的性質の制約を受ける。例えば、光学顕微鏡における分解能の限界は可視光線の波長域に因る部分が大きい。このような制約から逃れる為に、X線の透過や反射を利用したX線顕微鏡や、電子線を用いた電子顕微鏡といった、より短波長域の電磁波を利用した顕微鏡が開発された。また、トンネル効果を用いたトンネル顕微鏡や原子間力を用いた原子間力顕微鏡など、表面物理学を応用した顕微鏡も実用化されている。

[編集] 光学顕微鏡の種類

明視野顕微鏡: 試料を均一な入射光で照らした時、試料の各部分において光の吸収スペクトルが異なる為に透過光の像にコントラストが付くことを利用した顕微鏡。薄くて吸収率の小さい試料ではコントラストが低く明瞭な像が得られない為、染色を施すなどの必要がある。
暗視野顕微鏡: 透過光で観察する明視野顕微鏡とは異なり、試料へ斜めから光をあてて生じた散乱光や反射光を観察する方法である。この方法では明視野顕微鏡とは逆に、視野の背景が黒く抜け、試料が光って見える。通常の光学顕微鏡に暗視野コンデンサーを挿入するだけでこの方法が実現できる。または位相差顕微鏡を調節することでも暗視野法による観察が可能である。物体表面や内部の微細な構造の観察には不向きであるが、可視光の波長よりも小さな物体の存在を高いコントラストで観察することが可能である。
実体顕微鏡: 数mm～cm単位の、比較的大きな試料を反射光で観察するタイプの顕微鏡。観察倍率は数倍～数百倍と比較的低倍。検鏡しながら試料を解剖したりする用途に配慮し、視野の方向が逆転しない光学系を備え、試料と対物レンズとの距離が確保されている（対物レンズの焦点距離が大きい）のが特徴である。
金属顕微鏡: 金属表面の観察に特化した顕微鏡。対物レンズ側から光を試料にあてて反射光で観察する。
測定顕微鏡: 試料の計測を目的とした顕微鏡。ステージに測定機や測定目盛を持ち、視野にもミクロメーターやテンプレートが表示される。観察倍率の正確性と共に像の歪みを最小限に抑える事が要求される顕微鏡で、主光線がレンズ光軸に対して平行となるテレセントリック光学系を採用する例が多い。
位相差顕微鏡: 無色透明ではあるが屈折率が異なる部分からなる試料を観察する為の顕微鏡。屈折率が大きな媒質中を通る光は、屈折率が小さい媒質中を通る光よりもその位相が遅れる。この位相差に関わる回折光を利用する顕微鏡である。コンデンサーと対物レンズにより位相のずれた回折光同士を干渉させ、位相差を明暗に変えて観察する。この方法により、ほとんど透明な生物細胞の内部構造を観察することが可能である。位相差コンデンサーと位相差用対物レンズを利用する。1934年オランダのゼルニケ（Frits (Frederik) Zernike）が考案。1953年ノーベル物理学賞受賞。
微分干渉顕微鏡: 光の偏光性と干渉性を利用して、無色透明な細胞や金属表面の段差などを観察する顕微鏡。偏光素子とウオラストンプリズムやノマルスキプリズムによって光線を分離して試料面を通過させ、試料で生じる光路差の微分値を像面でコントラストに変える。試料面での光線の分離量をシアー量といい、分解能やコントラストに影響する。現在の顕微鏡では、スミス・ノマルスキ型という構成が多い。
偏光顕微鏡: 物体は内部構造や結晶構造によって、光の振動方向を変える偏光性を有する。この偏光性を観察する方法である。光学顕微鏡のコンデンサーの場所にポラライザー（偏光板）を置き、対物レンズの後ろに遅延版とアナライザー（偏光板）を置き、試料の偏光性や複屈折性を明暗や色の違いとして観察する。偏光板の回転に応じて、結晶などは鮮やかな色で観察される。岩石などの結晶や生物試料の観察に用いられる。; 偏光顕微鏡の欠点であるアナライザーの回転の煩わしさと、得られた画像データの解析処理の複雑さを簡便にするシステムとして、近年 LC-Polscope が発明された。これは電子的に制御できる偏光板と画像解析装置を組み合わせたもので、結晶構造の偏光方向（slow axis orientation）と偏光の強さ（retardation）が一度の観察で得られる。無染色、無侵襲で細胞骨格が観察できるため、人工授精させた家畜の受精卵の選別などに用いられている。
蛍光顕微鏡: 蛍光顕微鏡とは、試料から発せられる蛍光を観察する顕微鏡のこと。蛍光とは、観察したい試料に光を当てたときに試料から発せられる光のことで、多くの場合非常に微弱なので、試料に当てる光が、蛍光を邪魔して見えなくならないように工夫が施されている。; 通常の明視野顕微鏡と異なり、蛍光顕微鏡では、あらかじめ光源から出る光の波長を何らかの方法で制限し、ある特定の波長だけが試料に当たる様にしている。もし、観察試料にその波長の光を受けると蛍光を発する物質が含まれていれば、試料から出る蛍光を顕微鏡下で観察できる。通常、物質が発する蛍光の波長は、蛍光を出させるためにあてる光（励起光）の波長とは異なる、より長い波長の光であり、蛍光を出す物質によりその波長は決まっている。一方、試料に当てた光が単に反射してきた光は、もとの波長と同じ波長の光なので、試料から発せられた蛍光とは、その波長によって区別することができる。通常、波長によって透過率の異なるフィルタや、プリズムなどを用いることで、蛍光だけを観察することが可能となる。この際、光源から試料にあてる光に、蛍光と同じ波長の光が含まれていないことが重要となる。; 光源としてよく用いられるのは水銀ランプである。水銀ランプから発せられる光は、連続的な波長の光を含まず、飛び飛びの波長を持ついくつかの特定の波長の光が混ざったものである。これは水銀の放射スペクトルの波長で、254 nm、365 nm（紫外線）、405 nm（青色光）、546 nm（緑色光）などが混ざっている。この光に、フィルタを通し、特定の波長の光だけを試料に当てる。; 光源の光を顕微鏡の鏡筒の途中（接眼レンズと対物レンズの間）から波長フィルタを兼ねたダイクロックミラー（dichroic mirror）で導入し、対物レンズを通して、試料の中の観察部だけに励起光を当て、同じ対物レンズを用いて蛍光を観察する落射式蛍光顕微鏡が一般的である。通常の明視野顕微鏡に蛍光顕微鏡用のオプション機器を取り付けることで蛍光顕微鏡として使える場合が多い。; 得られる像は、暗い視野の中に蛍光を発する部分がボーッとあるいはくっきりと光って見える像であり、蛍光が微弱な場合には暗い部屋での観察が必要な場合が多い。接眼レンズを通しての肉眼観察に加えて、1990年代以降はCCDカメラを用い、感度が飛躍的に高まった観察装置が一般化してきており、肉眼では観察不可能な微弱な蛍光を、高感度CCDカメラを用いて可視化することも行われている。; CCDカメラを撮影に利用することのもう１つの利点は、コンピュータを用いた画像処理が容易になったことである。単に「画像のコントラストの強調が簡単になった」といった利点のみではなく、『複数画像を比較計算することにより、焦点面以外からの光を除く』といった処理も可能になった（例：ApoTome、Deconvolution）。このような数学的画像処理により共焦点レーザー顕微鏡にせまる空間解像力を得ることも可能になっている。
共焦点レーザー顕微鏡: 光源としてガスレーザー、半導体レーザー、そして白色光源も光源として用いられる。レーザーを対物レンズから走査し、励起された試料から放出された蛍光（ないしは試料から反射した光）をピンホールを通した後に検出装置を用いて検出、コンピューター上にて画像を再構成する。ピンホールを用いることによって同一焦点（共焦点）面以外からの蛍光をシャットアウトすることができるので、開口数に依存した厚さの光学切片像を得ることができる。たとえばArレーザー(波長488nm)で開口数1.33のレンズを用いたときには厚さ約200nmの光学切片を得ることとなり、透過型電子顕微鏡には大きく劣るものの、従来の光学顕微鏡よりも高い空間解像力を容易に得ることができる。透過型電子顕微鏡の場合と比べて、試料作成が簡単であることも相俟って、1990年代以降、生物学分野にて飛躍的に普及した。欠点としてはその価格の高さ(最低でも1000万円はかかると考えられる）があり、設置台数は各研究機関に数台という程度であるという。; 光学系としては、主に生物用に使用される蛍光用共焦点顕微鏡と、主に工業用に使用される反射型の共焦点顕微鏡の２種類がある。生物用は、細胞や組織の研究に、工業用は材料の表面検査や半導体の検査などに用いられている。; 走査方式は、試料を固定した状態でレーザーをミラーや回転ディスクにより走査するビーム走査型と、光ビームは固定して試料（スライドガラス）をＸＹに走査する試料走査型がある。後者はＤＮＡマイクロアレイの測定などに使用されている。
全反射蛍光顕微鏡: 蛍光顕微鏡の照明に全反射を利用する方法。光は屈折率の大きい媒質から屈折率の小さい媒質に、ある角度より大きな角度で入射すると、全反射が起こる。全反射の際には境界面に光のしみ出し（エバネッセント波）がある。プレパラートなどで、屈折率の大きいスライドガラスと、それより小さい水の境界面でもこれらの現象が起こるので、蛍光顕微鏡でガラス面で全反射になるような照明を用いると、ガラス面の近傍の試料のみ選択的に蛍光観察ができる。蛍光検出力は生体１分子をも達成し、一分子細胞生物学に貢献している。1990年代、日本で大きく発展した。
ラマン顕微鏡: レーザーラマン顕微鏡とも呼ばれる。顕微鏡に応用されるものは通常のラマン効果ではなく、エネルギーのより大きい共鳴ラマン効果である事が多い。ラマン散乱光の波長（波長シフト量）は、試料に存在する分子、結合、結晶格子等の振動数に依存する物質固有の値である。従って試料のラマン散乱スペクトルから、その試料に含まれる物質を同定し、同時に局在を見ることが可能となる。ラマン散乱光は微弱であり、従来はその検出やイメージングに要する時間が現実的なものではなかったが、光学系の工夫とプロセッサの発達に伴う演算時間の短縮により、顕微鏡への実装が可能となった。物質の同定能力としては質量分析やX線元素分析に及ばないが、未処理の対象を生きたまま観察できる点は、非常に大きなアドバンテージである。
蛍光ミュラー行列顕微鏡