Microtensométrie

Un article de Wikipédia, l'encyclopédie libre.

INTERACTION LIPIDE-PROTEINE A L'INTERFACE EAU-AIR

sommaire

I. INTRODUCTION 3 II. PRINCIPE ET RAPPELS 3 A. Principe 3 B. La membrane plasmique 3 1. Son organisation et ses constituants 3 a) Les protéines 4 b) Les lipides 5 c) État physique des lipides membranaires 7 2. Rôles et propriétés de la membrane 7 III. EXPERIENCE ET APPAREILLAGE 8 A. Appareillage 8 B. Théorie 9 1. Courbe dose 9 2. Cinétique d'interaction 10 3. Courbe de spécificité 11 IV. APPLICATIONS 12 V. CONCLUSION 15

TABLE DES ILLUSTRATIONS

Figure 1 : Représentation schématique de la membrane plasmique 4 Figure 2 : Glycosphongolipides 5 Figure 3 : Les sphyngolipides 6 Figure 4 : Cholestérol 7 Figure 5 : Cuve de LANGMUIR 8 Figure 6 : Injection de la solution 9 Figure 7 : Courbe dose 10 Figure 8 : 10 Figure 9 : Cinetique d'interaction 11 Figure 10 : Courbe de Spécificité 11 Figure 11 : Représentation schématique du virus VH1 12 Figure 12 : Fusion du VIH1 au niveau d'un microdomaine glycolipidique 14

I. INTRODUCTION

Les interactions lipides/protéines à l'interface air/eau sont étudiées au sein du Laboratoire de Biochimie et de Physico-chimie des Membranes Biologiques par l'équipe du Pr. Jacques FANTINI. Leur but est d'étudier la manière dont les constituants de la membrane biologique interagissent entre eux et avec les éléments extérieurs. Ces interactions peuvent se réaliser:  soit entre lipides  soit entre lipides et protéines

II. PRINCIPE ET RAPPELS

A. Principe L'utilisation des films monomoléculaires permet d'étudier l'interaction de protéines et de lipides avec un film lipidique monomoléculaire. L'intégration d'une molécule dans une monocouche de lipides induit une variation de la pression de surface à l'interface eau/air. B. La membrane plasmique 1. Son organisation et ses constituants

La membrane a deux rôles qui semblent « incompatibles » :  Isoler une entité vivante de son environnement  Communiquer sélectivement avec cet environnement (échange de matière et d'informations). La membrane est indispensable au déroulement des processus biologiques car elle maintient les différences essentielles entre le contenu des compartiments qu'elle délimite, et leur environnement. Elle forme ainsi des frontières dont la traversée est hautement contrôlée. La membrane biologique est une bicouche phospholipidique, d'épaisseur moyenne 7,5 nm, dans laquelle sont insérée, de manière asymétrique, des édifices macromoléculaires de nature protéique et/ou glycoprotéique. Ainsi, on peut observer deux types de versants :  un extracellulaire qui porte des sucres associés à des protéines ou lipides  un intracellulaire, presque jamais glycosylées.

Les différents éléments constituant cette structure ne sont pas liés par covalence, mais par différents types de liaisons faibles (force de Van Der Waals, ponts hydrogènes).

FIGURE 1 : REPRESENTATION SHEMATIQUE DE LA MEMBRANE PLASMIQUE

a) Les protéines

Suivant leur origine, les membranes renferment de 40 à 70 % de protéines réparties dans la bicouche lipidique, ce sont ces protéines qui donneront une fonction spécifique à la membrane concernée. En fonction de l'importance de leur partie hydrophobe, on distingue :  les protéines intégrales ou intrinsèques Elles sont incluses dans la matrice lipidique. Ces dernières ne peuvent être isolées que quand l'agencement membranaire aura été détruit à l'aide de détergents. Les deux feuillets de la membrane peuvent renfermer:  Soit des domaines différents d'une protéine intrinsèque,  Soit des protéines différentes, ce qui augmente leur asymétrie.

 les protéines extrinsèques Ces protéines permettent d'établir des interactions avec des protéines préalablement ancrées aux membranes. Leur rôle est donc de maintenir les protéines au voisinage de la membrane.  Les glycoprotéines et les glycolipides La membrane plasmique comporte également des composés polysaccharidiques (2 à 10%), sous forme de glycoprotéines et de glycolipides. Ces composés polysaccharidiques sont très hydrophiles et sont positionnés sur la face externe de la membrane plasmique, accentuant encore son asymétrie. Ces compositions osidiques jouent un rôle important dans les phénomènes de communication et de reconnaissance intercellulaire.

b) Les lipides

Les lipides membranaires sont de petite taille et amphipathiques (un pôle hydrophobe et un pôle hydrophile). On peut ainsi distinguer :  le pôle hydrophobe qui est représenté par les deux queues à longues chaînes d'acide gras, orientées à l'intérieur de la structure  le pôle hydrophile représenté par la tête des lipides, et orientée vers l'extérieur de la structure.

Les principaux types de lipides que l'on rencontre dans les membranes sont:  des glycérophospholipides qui sont des lipides membranaires majoritaires à 90 %. Ils sont construits sur la base des glycérols.

FIGURE 2 : GLYCOSPHINGOLIPIDES (LE GAL CER)

 des sphingolipides qui sont formés à partir de sphingosine qui est une chaîne carbonée à 18 carbones. Une sphingosine et un acide gras forment une céramide. Les sphingolipides sont un groupe de lipides comportant:  Une partie hydrophobe (céramide)  Un groupement hydrophile. Le squelette de tous les sphingolipides est une céramide qui résulte de la condensation d'une sérine avec un acide gras, acide palmitique le plus souvent, suivie d'une acylation (ajout d'un acide gras). Ces acides gras sont habituellement saturés et comportent de 14 à 30 atomes de carbone. Ceux-ci peuvent présenter ou non une particularité au niveau de l'atome de carbone situé en du groupement CO.  Si OH est en  du carboxyle, alors il s'agit d'un acide gras  hydroxylé.  S'il n'y a pas de OH, alors il s'agit d'un acide gras non hydroxylé.

Les sphingolipides peuvent être séparés en 2 classes :  Si, à la céramide on ajoute une phosphorylcholine, on obtient alors un sphingomyéline.  Si, à la céramide on ajoute un sucre, on obtient alors un glycosphingolipide.

La sphingomyéline est le sphingolipide le plus répandu dans les membranes cellulaires. Elle est présente dans les membranes de tous les organites cellulaires, mais 90% sont localisés dans la couche externe de la membrane plasmique (vers le milieu extra-cellulaire). Les contenus en cholestérol et en sphingomyéline des membranes sont étroitement corrélés. Ces deux molécules sont présentes dans les mêmes microdomaines membranaires.

FIGURE 3 : LES SPHINGOLIPIDES

 le cholestérol (seulement chez les animaux) qui interviennent dans la fluidité et la stabilité mécanique de la membrane.

FIGURE 4 : CHOLESTEROL

c) État physique des lipides membranaires

 Notion de température de fusion (Tm)

La température de fusion est la température de transition gel-liquide. L'existence d'une hétérogénéité de lipides dans la membrane présentant des Tm différentes se traduit par la présence de microdomaines. Dans la membrane, la présence de glycophospholipides induit une phase lipidique fluide (pour un taux de 90%) et celle de sphingolipides, une phase solide. Par exemple, pour l'huile et le beurre lorsqu'on veut les mélanger, il faut chauffer pour dépasser la Tm du beurre et obtenir la phase liquide. Ainsi, les sphingolipides vont se regrouper en microdomaines lipidiques appelés « raft » qui ne sont pas désorganisés par l'action de détergents. Cette propriété les différencie du reste de la bicouche lipidique. Les microdomaines de glycosphingolipides ont pu être mis en évidence au niveau de la membrane plasmique grâce à leur insolubilité dans le détergent triton-X100 à 4°C (Brown et Rose, 1992). En fait, les lipides, qui sont dans un état fluide sont généralement incorporés dans des micelles mixtes sous l'action du détergent, alors que les lipides qui se trouvent à l'état gélifié ou liquide ordonné ne sont pas solubilisés. Certains domaines membranaires correspondent à des régions spécialisées en terme de composition en protéines 2. Rôles et propriétés de la membrane

La bicouche phospholipidique présente un double rôle :  solvant des protéines hydrophobes  barrière de perméabilité (vis à vis de substances polaires et de substances chargées). En ce qui concerne son second rôle un point est à retenir. En effet, du fait de sa partie centrale hydrophobe, la bicouche lipidique a une faible perméabilité aux substances hydrophiles comme les ions, l'eau et les molécules polaires. Ainsi, les ions ne peuvent traverser passivement la membrane qu'au niveau de protéines spécialisées : les protéines-canaux. De même, ils ne traversent activement la membrane qu'au niveau des pompes ou des transporteurs. Cette organisation permet la régulation du passage des ions, passage focalisé au niveau de protéines dont l'ouverture (protéines-canaux) ou le fonctionnement (pompes - transporteurs) sont étroitement contrôlés.

Cette bicouche phospholipidique est imperméable aux composés hydrosolubles ; elle est fluide car chaque élément peut tourner sur son axe et diffuser rapidement dans le sens latéral. Ce degré de fluidité va dépendre de la composition de la bicouche (modèle membranaire de la « mosaïque fluide » par Singer et Nicholson), mais également en fonction des conditions du milieu et notamment de la température (la fluidité a tendance à augmenter avec la température). Pour qu'une membrane accomplisse efficacement son activité et ses fonctions, il faut qu'elle présente une fluidité optimale. La fluidité de la matrice lipidoprotéique est à l'origine de la capacité de fusion des membranes et de l'homogénéisation des composants de la structure ainsi reconstituée. Ces propriétés sont fondamentales pour les échanges intra et extracellulaires. Cette capacité de fusion est due à l'universalité de la structure membranaire et à la nature non spécifique des interactions hydrophobes qui maintiennent l'intégrité de la structure et qui guide sa constitution.

III. EXPERIENCE ET APPAREILLAGE A. Appareillage

Nous utilisons un tensiomètre pour mesurer la tension superficielle d'une monocouche lipidique après insertion d'une solution contenant des protéines. Le fonctionnement du tensiomètre repose sur le principe de la « balance de Langmuir ».

FIGURE 5 : CUVE DE LANGMUIR

Nous disposons d'une plaque en téflon avec une multitude de cuves (15 puits par plaques). Dans les cuves sera placées tout d'abord de l'eau stérile. On placera l'aiguille en platine à une profondeur de deux millimètres afin de faire le zéro et avant la formation de la moncouche lipidique qui se formera autour de l'aiguille. Nous injecterons ensuite le dépôt de lipides afin d'obtenir la monocouche à l'interface.

FIGURE 6 : INJECTION DE LA SOLUTION

Une fois le film monomoléculaire formé nous injectons une solution contenant des protéines qui vont venir s'intercaler entre les lipides de la monocouche ce qui provoquera une augmentation de la pression de surface. L'aiguille va enregistrer les variations de l'état de compaction du film en fonction du temps, après l'injection de la solution contenant des protéines. L'aiguille est reliée au tensiomètre qui rapportera les évolutions de la tension. Toutes les informations sont envoyées à un ordinateur équipé du logiciel pouvant traiter les données. Nous visualiserons l'augmentation de la pression de surface via une courbe tracée par l'ordinateur.

B. Théorie 1. Courbe dose

Une fois le film monomoléculaire créé, une « courbe dose » va être réalisée afin de connaître la concentration en peptides à injecter. Plusieurs concentrations sont testées, leur  max est ensuite reporté sur un graphe en fonction de la concentration en peptide. La concentration a injecter choisie correspond à un  max sur le « plateau » de la courbe.

FIGURE 7 : COURBE DOSE 2. Cinétique d'interaction

Une courbe de cinétique d'interaction est réalisée à la pression d'insertion choisie de la couche lipidique (10 mN/m). Peu après l'injection, on observe une augmentation de la pression des molécules à la surface du film monomoléculaire, au moment où le peptide s'insère dans ce dernier. Un  max est observé. L'opération est répétée pour les différentes pressions d'insertion (de 10 à 30 mN/m).

FIGURE 8 :

FIGURE 9 : CINETIQUE D'INTERACTION 3. Courbe de spécificité

Les  max sont reportés en fonction des différentes pressions initiales. On prolonge la courbe de tendance formée par les points. Le point où la courbe coupe l'axe des abscisses caractérise la pression critique d'insertion. Si cette pression critique d'insertion dépasse une certaine valeur (environ 20-25 mN/m), on dit que l'interaction est spécifique entre le peptide et le lipide, le peptide injecté a assez d'affinité pour s'intercaler au milieu des lipides formant le film monomoléculaire.

FIGURE 10 : COURBE DE SPECIFICITE

IV. APPLICATIONS

Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) appartient à la famille des rétrovirus qui sont les seuls virus diploides car, en effet, leur génôme est constitué de deux molécules d'ARN identiques de polarités positives, reliés par un pseudo-appariement des extrémités 5'. Les particules virales sont de formes sphériques composées d'une nucléocapside entourée d'une enveloppe externe hérissée de spicules. La pénétration de la nucléocapside à l'intérieur de la cellule cible est assurée par son adhésion à la membrane plasmique, au niveau de sites récepteurs spécifiques, suivie de la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane plasmique de la cellule cible. Le VIH regroupe deux types distincts :  VIH 1  VIH 2

L'interaction du VIH1 avec la membrane plasmique des cellules cibles implique deux glycoprotéines de l'enveloppe virale :  Glycoprotéines externes de surface assurant la reconnaissance des récepteurs cellulaires (gp120)  Glycoprotéines transmembranaires assurant la fusion proprement dite (gp41)

FIGURE 11 : REPRESENTATION SHEMATIQUE DU VIRUS VH1

La fixation du VIH-1 sur la membrane de la cellule cible implique des changements conformationnels majeurs au niveau de la glycoprotéine de surface, la gp120. La gp120 se fixe sur le récepteur CD4, récepteur protéique localisé dans les rafts, à la surface de la cellule cible ce qui entraîne le premier changement conformationnel. Il y a alors apparition de la boucle V3, qui était jusqu'à maintenant partiellement masquée, représentant le domaine hypervariable de la gp120 jouant un rôle essentiel dans la fusion virus-cellule. La région de la gp120 comprenant la boucle V3 interagit avec un cofacteur de fusion de la cellule cible, ce qui permet l'interaction du peptide de fusion avec la membrane plasmique de cette cellule. Le peptide de fusion est protégé dans la zone hydrophobe constituée par le repliement spécifique de la gp120. Quand celle-ci se fixe sur le corécepteur, le second changement conformationnel se met en place et il y a extirpation de la gp41 de cette zone. Le peptide de fusion de la gp41 est alors confronté au milieu aqueux et s'insère dans la membrane plasmique de la cellule cible pour minimiser cette contrainte énergétique. La nature du cofacteur peut varier mais les deux principaux sont CXCR4 et CCR5 qui sont des protéines à sept domaines membranaires. Ce mécanisme complexe de fusion nécessite le regroupement de différentes protéines membranaires au niveau du site de fusion, appelé raft. À l'origine, seul le récepteur CD4 est associé au raft. Quand le virus s'y fixe, il est embarqué sur le raft puis dérive dans la membrane jusqu'à atteindre le corécepteur fonctionnel. Or si la gp120 est absente, CXCR4 ne se lie pas physiquement, car celle-ci induit la réorganisation du raft pour livrer le complexe CD4-gp120 aux corécepteurs fonctionnels.

FIGURE 12 : FUSION DU VIH1 AU NIVEAU D'UN MICRODOMAINE GLYCOLIPIDIQUE

V. CONCLUSION

La membrane plasmique, de part son hétérogénéité de structure (composition, fluidité) est le siège de nombreux processus biologique. Ces processus peuvent être de nature diverses mais celui qui concernent les interactions entre lipides et lipides / protéines au niveau des membranes, tient un rôle relativement important. Cette propriété a en effet permis aux chercheurs de comprendre comment se déroulait certains phénomènes biologiques qui peuvent prendre de nos jours une inquiétante importance (comme celui de l'interaction du VIH ou du prion avec les membranes). Ainsi, ces études nous permettent d'espérer maîtriser, avec plus de précision, les différentes étapes qui vont pouvoir éventuellement aboutir à l'apparition d'une maladie, et par la même envisager de trouver par l'intermédiaire de recherches complémentaires, des moyens qui pourront soit la ralentir, soit l'enrayer.