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L'exonucléase est une nucléase, une enzyme qui coupe l'ADN ou l'ARN à partir d'une extrémité[1], un nucléotide à la fois, et dans un sens : 5' vers 3' ou l'inverse.
Par exemple, l'exonucléase III fonctionne a partir de l'extremité 3' (sauf si celle ci est protubérante). Cette enzyme catalyse l'hydrolyse séquentielle des nucléotides d'un ADN double brin dans le sens 3'->5'. Elle libère des monodesoxynucléotides à partir de l'extrémité 3'd'un ADN bicaténaire. Elle est inactive sur ADN simple brin. Elle agit sur des ADN double brins obtenus par coupure franche avec des enzymes de restriction ou sur ADN double brin dont les extrémités 3'(OH) sont en retrait.
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