Fluoreszenzmikroskopie

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Endothelzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Die Mikrotubuli sind grün, Aktinfilamente sind rot markiert worden. Die DNA in den Zellkernen wurde mit DAPI angefärbt.

Immunfluoreszenz-Aufnahme im Spinalganglion der Ratte. Zwei verschiedene Proteine wurden mit rot oder grün fluoreszierenden Markern gefärbt.

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezielle und moderne Form der Lichtmikroskopie.

[Bearbeiten] Prinzip

Die Funktion eines Fluoreszenzmikroskopes beruht stets auf folgenden Prinzipien:

• Im zu untersuchenden Präparat befinden sich fluoreszierende Stoffe (Fluorochrome) die mit Licht einer bestimmten Wellenlänge zum Leuchten angeregt werden.
• Die so angeregten Fluorochrome emittieren Licht, welches langwelliger als das anregende Licht ist.
• Beide Wellenlängen können im selben Strahlengang optisch getrennt werden und
• die Größe der zu untersuchenden Objekte kann aufgrund ihres Eigenleuchtens weit unter der Auflösungsgrenze eines Lichtmikroskopes liegen.

Der Grundaufbau der meisten Fluoreszenzmikroskope entspricht dem eines Auflichtmikroskopes. Das zu beobachtende Objekt wird dabei nicht durchstrahlt, sondern durch das Objektiv beleuchtet. (Die korrekte Bezeichnung lautet daher Epifluoreszenzmikroskop). Als Lichtquellen werden in der Regel Quecksilberdampflampen oder Laser eingesetzt. Quecksilberdampflampen emittieren Licht über das gesamte sichtbare Spektrum sowie Ultraviolett. Die für die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes notwendige Wellenlänge wird mit optischen Filtern isoliert und das einfarbige Licht auf das Objekt geleitet, worauf dieses zu fluoreszieren beginnt. Das emittierte, längerwellige Fluoreszenzlicht wird durch das Objektiv gesammelt. Im Strahlengang befindliche Farbteiler trennen anschließend das Fluoreszenzlicht vom anregenden Licht und leiten es in das Okular des Mikroskopes oder auf einen elektronischen Verstärker (Photomultiplier).

[Bearbeiten] Anwendungen

In der Biologie werden Fluoreszenzmikroskope vielfältig eingesetzt. Im einfachsten Falle werden Zellbestandteile, die von Natur aus fluoreszieren (Autofluoreszenz) sichtbar gemacht. Dies ist vor allem bei Pflanzen möglich, denn Chlorophylle und andere pflanzliche Pigmente haben die natürliche Eigenschaft, zu fluoreszieren. Im Allgemeinen ist diese Eigenschaft aber unerwünscht, denn unspezifische Autofluoreszenz verschiedener Zellbestandteile führt zu starken Hintergrundsignalen.
Die wichtigsten Anwendungen basieren auf der spezifischen Färbung einzelner Zellbestandteile, meist bestimmter Proteine. Diese werden zuvor entweder mit Hilfe spezifischer Antikörper (Immunfluoreszenz) oder durch Fusion mit einem fluoreszierenden Protein markiert. Aus dem fluoreszenzmikroskopischen Bild können anschließend Rückschlüsse auf die Lokalisation des Proteins in der Zelle gezogen werden (zum Beispiel im Kern, im Cytoplasma, membrangebunden oder nach außen exportiert). Selbst Interaktionen von Proteinen untereinander sind beobachtbar. Je nach angewandter Methode ist auch die Verfolgung einzelner Vorgänge in lebenden Zellen möglich.

Heute existiert eine breite Palette an Fluoreszenzmarkern, Markierungsmethoden und Mikroskopietechniken. Einige sehr spezielle Formen der Fluoreszenzmikroskopie werden im Folgenden beschrieben.

[Bearbeiten] Konfokalmikroskopie

Bei der Konfokalmikroskopie, wie auch bei ihrer speziellen Form der Konfokalen Laser Scanning Mikroskopie (CLSM), gelangt durch den Einsatz einer Lochblende nur Fluoreszenzlicht eines winzigen Teiles der angeregten Probe in das Mikroskop. Das Anregungsvolumen wird so auf weniger als ein Femtoliter (0,000 000 000 000 001 Liter) beschränkt. Dies hat den entscheidenden Vorteil, dass Hintergrundsignale ebenfalls fluoreszierender Bestandteile aus höher oder tiefer liegenden Schichten des Präparates ausgeblendet werden können. Auf diese Weise ist Mikroskopieren in mehrschichtigen Präparaten, zum Beispiel in ganzen Blättern oder tierischen Embryos, möglich. Durch Scannen übereinander liegender Schichten können außerdem dreidimensionale Bilder erstellt werden.

[Bearbeiten] STED-Mikroskopie

Bei der STED-Mikroskopie (STED steht für Stimulated Emission Depletion) wird eine Auflösung bis zu 50 nm erreicht. Die Anregung erfolgt durch Kombination von UV-Licht mit einem nachfolgenden roten Lichtstrahl. Dabei fallen die angeregten Moleküle an den Rändern wieder in den Normalzustand zurück. Für biologische Systeme ist dieses Verfahren allerdings noch nicht ausgereift, da der Energieeintrag in die Probe zu groß ist.