DAPI
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DAPI (IUPAC-Bezeichnung: 4',6-Diamidino-2-phenylindol) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der in der Fluoreszenzmikroskopie zur Markierung von DNA eingesetzt wird.
Die Verbindung lagert sich bevorzugt an AT-reiche Regionen in der kleinen Furche der DNA an. Bei Anregung mit ultraviolettem Licht fluoresziert DAPI im sichtbaren Bereich mit blauer bis cyaner Farbe. In Verbindung mit doppelsträngiger DNA liegt das Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 358 nm, das Emissionsmaxium bei 461 nm.
DAPI kann auch an RNA binden, die in den meisten aktiven Zellen in großen Mengen vorhanden ist. Hierbei interkaliert es und fluoresziert weniger stark, das Emmissionsmaxium liegt dann bei 400 nm. Die Emissionsmaxima von DNA- und RNA-gebundenem DAPI unterscheiden sich damit genügend, um sie mit Hilfe von optischen Filtern und Farbteilern trennen zu können. DAPI wird deshalb eingesetzt, um (nur) DNA darzustellen und beispielsweise Zellkerne anzufärben. Dies ist mit vielen anderen Nucleinsäurefarbstoffen nicht möglich, weil die Emissionsspektren der DNA- und der RNA-gebundenen Varianten nahezu identisch sind. DAPI wird daher häufig als "DNA-spezifisch" bezeichnet, obwohl dies strenggenommen nur für die Emission bei 461 nm (blau) gilt.
DAPI emittiert am kurzwelligen (blauen) Ende des Spektrums des sichtbaren Lichtes. Daher können gleichzeitig weitere Fluoreszenzfarbstoffe mit langwelligeren Emissionsmaxima am selben Präparat eingesetzt werden, ohne dass es zu Signalüberschneidungen ("bleed through") kommt. DAPI kann zum Beispiel gleichzeitig mit grün, gelb oder rot fluoreszierenden Markern wie Fluorescein, Alexa 488, GFP, Texas-Red und vielen anderen angewendet werden. Aufgrund der einfachen Färbetechnik zählt DAPI auch heute noch zu den wichtigen Fluoreszenzfarbstoffen. Als nachteilig gilt jedoch, dass es nicht besonders stabil ist, es bleicht also verhältnismäßig schnell aus. Die ultraviolette Strahlung, die für die Anregung notwendig ist, erzeugt außerdem Radikale, die auch andere Fluorophore bleichen. DAPI wird deshalb häufig als letzter Farbstoff angeregt und sichtbar gemacht, um andere Marker zu schonen. Das Ausbleichen (fading) von DAPI kann durch den Einsatz von Anti-Fading-Mitteln verzögert und die Beobachtungsdauer am Mikroskop verlängert werden. DAPI ist in der Lage, intakte Zellmembranen zu durchdringen. Daher kann es auch die DNA lebender Zellen anfärben. Aufgrund der DNA-bindenden Eigenschaften ist es jedoch toxisch und mutagen. Außerdem ist die energiereiche ultraviolette Strahlung, die für Anregung des Farbstoffes benötigt wird, schädlich für lebende Zellen.
[Bearbeiten] Siehe auch
[Bearbeiten] Literatur
- Tanious, F.A. et al. (1992): DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) binds differently to DNA and RNA: minor-groove binding at AT sites and intercalation at AU sites. In: Biochemistry. Bd. 31, Nr. 12, S. 3103-3112. PMID 1372825
