HPLC
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HPLC steht für High Performance Liquid Chromatography (in den Anfangszeiten dieser Technik auch für High Pressure Liquid Chromatography), eine analytische Methode in der Chemie. Die HPLC ist eine Methode mit der man nicht nur Substanzen trennt, sondern diese auch über Standards identifizieren und quantifizieren (die genaue Konzentration bestimmen) kann. Das deutsche Wort Hochleistungs-Flüssigchromatographie wird nur sehr selten verwendet.
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[Bearbeiten] Funktionsweise
Es handelt sich um ein chromatographisches Trennverfahren, bei dem die zu untersuchende Substanz zusammen mit einem Laufmittel, der "mobilen Phase" (auch "Eluent" genannt) durch eine so genannte Trennsäule, die die "stationäre Phase" enthält, gepumpt wird. Üblicherweise geht der Trennsäule eine Vorsäule vorher, die wesentlich billiger als die Trennsäule ist und zur Abhaltung von Verunreinigungen dient, eine Trennsäule in einem HPLC-Gerät ist zwischen 1,8 und 30 cm lang und hat zumeist einen Innendurchmesser von 2-8 mm im Falle von analytischen HPLC-Systemen. Daneben findet die HPLC auch Verwendung für die Reinigung von Substanzen als (semi-)präparative HPLC. Die Innendurchmesser hier sind i. A. erheblich größer (bis zu 50 mm).
Der auf die wesentlichen Elemente reduzierte Aufbau einer typischen HPLC-Apparatur kann der nebenstehenden Abbildung entnommen werden.
Wechselwirkt ein Bestandteil der zu untersuchenden Substanz stark mit der stationären Phase, verbleibt er relativ lange in der Säule. Wechselwirkt er hingegen schwach mit der stationären Phase, verlässt er die Säule früher. Je nach Stärke dieser Wechselwirkungen erscheinen die Bestandteile der Substanz zu verschiedenen Zeiten (den "Retentionszeiten") am Ende der Trennsäule, wo sie dann mit einem geeigneten Detektor nachgewiesen werden können.
Es werden zwei Methoden unterschieden: Normal Phase (NP) und Reversed Phase (RP). Bei der NP-HPLC wird eine polare stationäre Phase (z.B. Silikagele/Kieselgel) genutzt. Die Stärke der Elutionskraft der mobilen Phase ist im allgemeinen abhängig von der Polarität. Die verschiedenen Lösungsmittel sind nach steigender Polarität in der eluotropen Reihe angeordnet. Je polarer eine mobile Phase ist, desto schneller wird eine Substanz eluiert. Polare Moleküle werden auf der Säule länger retardiert (zurückgehalten) als unpolare Moleküle und verlassen deshalb die Säule später.
Die RP-HPLC ist in der Praxis die gängigste Methode. 70% aller analytischen HPLC-Trennungen sind RP-Trennungen. Hier wird eine unpolare stationäre Phase verwendet und die Elutionskraft sinkt mit steigender Polarität. Die stationäre Phase wird hergestellt, indem man Silane welche mit langkettigen Kohlenwasserstoffen substituiert wurden, mit Silicagel reagieren lässt. Dabei wird die polare Oberfläche der Silicagel-Partikel mit einer unpolaren Schicht aus Alkanen überzogen, also die Polarität umgekehrt (engl.: "reversed") . Als mobile Phase werden meist Mischungen aus Wasser oder Puffer und Acetonitril, Tetrahydrofuran (THF) oder Methanol eingesetzt. Bei isokratischen Trennungen bleibt die Zusammensetzung der Mobilen Phase während der gesamten Zeit gleich. Bei Gradiententrennungen wird die Polarität des Fließmittelgemisches während der Analyse verändert. Besondere Anwendung findet die RP-HPLC bei der Auftrennung von polaren Analyten die auf Normalphasen zu hohe Retentionszeiten aufweisen würden. Dafür wird meist eine C18-Säule (also ein Octadecylsilan als Derivatisierungsreagenz für das Silicagel) eingesetzt, die Detektion erfolgt zumeist mittels UV- oder Fluoreszenzdetektor.
[Bearbeiten] Praktische Durchführung und Anwendungen
Eine chemische Verbindung kann man mittels HPLC identifizieren, indem man die Retentionszeit der unbekannten Substanz mit der eines Standards (einer bekannten Substanz) vergleicht (externe Standardisierung). Ist die Retentionszeit gleich, kann man der Probe mit der unbekannten Substanz auch etwas Standard zusetzen und untersuchen, ob beim Chromatogramm nach wie vor nur ein "Peak" sichtbar ist, ob ein "Doppelpeak" entstanden ist oder ob am Chromatogramm zwei getrennte "Peaks" mit sehr ähnlicher Retentionszeit sichtbar werden (interne Standardisierung). Nur in dem Fall dass nach Zusatz von Standard zur Probe nur ein "Peak" sichtbar ist, kann man davon ausgehen dass die chemische Verbindung in der Probe und im Standard identisch sind. Führt man dieses Experiment unter zwei unterschiedlichen Trennbedingungen (z.B. HPLC Trennungen mit zwei unterschiedlichen Säulen) durch, so kann man damit unbekannte chemische Verbindungen eindeutig identifizieren.
Will man die Konzentration einer chemischen Substanz bestimmen (z.B. von Vitamin E in einem pflanzlichen Öl) so kann man dies durchführen, indem man Standards dieser chemischen Substanz mit bekannten Konzentrationen herstellt und die Peak-Fläche der Standards mit den Peak-Flächen der Substanz in den Proben vergleicht.
HPLC wird nicht ausschließlich zu analytischen Zwecken eingesetzt sondern auch in der Chemischen-Industrie, um Produkt (z.B. Proteine) von Verunreinigungen zu trennen. Hierbei kommen Säulen mit bis zu 1 Meter Durchmesser zum Einsatz.
[Bearbeiten] Aktuelle Entwicklungen
Zur Zeit herrscht der Trend, immer höheren Probendurchsatz zu erreichen. Die Hersteller von HPLC Anlagen haben hierzu unterschiedliche Begriffe geprägt:
RRLC : Rapid Resolution Liquid Chromatography
UFLC : Ultra Fast Liquid Chromatography
UPLC : Ultra Performance Liquid Chromatography
Bei diesen Verfahren wird die Analysenzeit durch optimierte Anlagenbauteile verkürzt (z.B. schnelle, verschleppungsarme Probengeber, empfindliche Detektoren, geringe Gradientenverzögerung)
[Bearbeiten] Detektoren
- UV/VIS-Detektor
- - festgelegte Wellenlänge
- - einstellbare Wellenlängen
- - Diodenarraydetektor(DAD)
- - Variabler Wellenlängendetektor(UV-Detektor)
- Lichtstreudetektor
- Fluoreszenzdetektor, dabei wird der Detektor im 90° Winkel zur Lichtquelle positioniert. Das emittierte Licht ist die Fluoreszenz. Der Vorteil genüber dem UV-Detektor ist die etwa tausendfach erhöhte Empfindlichkeit.
- Brechungsindexdetektor
- Massenspektrometer
- Leitfähigkeitsdetektor
- Elektrochemischer Detektor
