CDNA
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cDNA (von eng. complementary DNA) ist eine DNA, die mit Hilfe der Reverse Transkriptase meist aus mRNA hergestellt wird. Eingesetzt wird cDNA in der Molekularbiologie, Genomanalyse sowie in der medizinischen Forschung und Diagnostik.
Inhaltsverzeichnis |
[Bearbeiten] Synthese
Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase kann aus RNA die dazu komplementäre cDNA hergestellt werden. Diese spezifische, RNA-abhängige DNA-Polymerase benötigt wie andere Polymerasen einen Primer (ein kurzer, komplementärer DNA-Abschnitt) zur Synthese, welcher an die RNA bindet. Meist wird als Primer ein Oligo-dT-Abschnitt (10-15 Thyminbasen), welcher komplementär zum Poly-A-Schwanz der eukaryotischen mRNA ist oder 'random' Hexamere (6 zufällig zusammengesetzte Basenpaare) eingesetzt. Es können aber auch spezifische Primer eingesetzt werden, um gezielt ein Genprodukt zu isolieren.
[Bearbeiten] Anwendungen und Bedeutung
Über PCR lassen sich cDNA-Sequenzen nachweisen und auch vermehren. Über quantitative PCR lässt sich die Expressionrate der jeweils zugrundeliegenden mRNA darstellen, so dass sich in der Forschung und Diagnostik Unterschiede in der Genexpression von verschiedenen Gewebe oder aber gesundem zu erkranktem Gewebe nachweisen lassen. Weiterhin wird cDNA in der Diagnostik zum Nachweis von Erregern verwendet, z.B. von HIV im Blut von Patienten.
Durch die Klonierung und Sequenzierung (DNA-Sequenzierung, Expressed sequence tags (EST)) von cDNA kann die Struktur der entsprechenden Gene durch deren Projektion auf das entsprechende Genom analysiert werden. Die cDNA ermöglicht so auch Informationen zu alternativem Splicing zu gewinnen, d.h. welche Variante in welchem Gewebe oder Zelltyp vorkommen und wo Intron-Exon-Grenzen sich im Gen befinden. Weiters kann aus cDNA an Hand des genetischen Codes die Aminosäuresequenz eines Proteins eindeutig abgeleitet werden und so ein cDNA-Klon zum Exprimieren der entsprechenden Proteine genutzt werden (rekombinante Proteinexpression).
cDNA wird aber auch zur Untersuchung von nicht-Protein-codierender RNA (ncRNA) verwendet.
[Bearbeiten] cDNA in einer cDNA-Bank
Eine cDNA-Bank oder auch cDNA-Bibliothek ist eine Sammlung von vielen cDNA-Sequenzen, die von der mRNA einer bestimmten Zelle oder eines Gewebes präpariert wurde und repräsentiert im Idealfall die Gesamtheit der exprimierten Gene (=Transkriptom) der untersuchten Probe. Die cDNA-Stücke werden in der Regel in Plasmide eingefügt, die in Bakterien oder Phagen vermehrt werden (Klonierung). Eine solche cDNA-Bank kann dann z.B. für Screening-Verfahren genutzt werden. Eine typisches Screening Verfahren ist die Untersuchung der Genexpression mit Microarrays. Mit dieser Methode können in kurzer Zeit Genexpressionsmuster verschiedener Proben verglichen werden. Auch unbekannte Interaktionspartner können so untersucht werden, z.B. im Hefe-Zwei-Hybrid-System.
