YAC
De Viquipèdia
Els YAC (Yeast autonomous Cromosom) són cromosomes autònoms de llevat i per tant, permeten la replicació en llevat.
Tenen dos telòmers, un centròmer, origen de replicació eucariota, origen de replicació procariota i resistència a l'ampicil·lina.
Es poden recircularitzar utilitzant dianes Bam i induint-los en E.coli, on replicaran bé si no tenen l'insert.
Taula de continguts |
[edita] Mètode d'obtenció
Es pren recircularitzat, es difereix amb Bam i s'obté una cromàtida de la forma:
Telòmer==============Telòmer.
Es digereix amb EcoRI i s'obté 2 fragments. Per inserir l'ADN en un YAC calen fragments de 300 – 500 Kb, que són molt més grans que la màxima mida que s'obté en una extracció d'ADN normal.
[edita] Avantatges dels YACs
- Admeten fragments molt grans (400 Kb) com més grans són els elements d'inserció més estables són els YACs.
- Repliquen bé seqüències palidròmiques, la qual cosa sempre és un problema amb E coli.
[edita] Inconveninents dels Yacs
- Poden recombinar fàcilment:
- Entre YACs
- Amb els cromosomes de llevat.
[edita] Obtenció de l'ADN clonable
Per obtenir ADN per clonar en un YAC cal fer-ho per electroforesi de camp pulsant, per impedir que es donin forces de cisallament.
Es posa les cèl·lules de les que en volem obtenir l'ADN a dins d'un bloc d'agarosa. Per no trencar l'ADN cal que estigui sempre dins el bloc d'agarosa. Es tracta amb SDS i proteïna K per eliminar la proteïna del bloc d'agarosa. Després cal eliminar l'SDS i la proteïna K (pas difícil).
Es difereix parcialment amb EcoRI (1 de cada 100 dianes). És difícil perquè ha de passar per l'agarosa. També és difícil estandaritzar.
Després fem electroforesi de camp pulsant; es va alternant el camp elèctric, cosa que fa que l'ADN faci un camí i això permet aïllar fragments 10, 100 i 1000 vegades més grans que amb l'electroforesi normal.
