Primer

Een primer is een klein stukje enkelstrengs DNA dat gebruikt wordt als startpunt van de PCR (polymerase chain reaction). Er zijn steeds twee primers nodig, één voor de 5'-streng en één voor de 3'-streng. Deze worden de forward en de reverse primer genoemd.

De beste primer voor een PCR is een korte streng, waarvan de sequentie alleen overeenkomt met het stuk DNA voor het DNA fragment (vaak een gen/exon)en na het DNA fragment dat men wil dupliceren. Is dit namelijk niet het geval, dan zal de primer op meerdere plaatsen binden aan het DNA en dus stukken gaan dupliceren die niet gewenst zijn.

Vanaf de primer wordt het DNA richting 5' gekopieerd.

[bewerk] Samenstelling

De ideale primer is tussen de 18 en 24 baseparen lang, bevat 50% GC nucleotiden en bestaat uit een willekeurig mengsel van nucleotiden. Het punt waarop de twee DNA-strengen uit elkaar gaan (Tm) wordt het 'smeltpunt' (denaturatie) genoemd en ligt van een dergelijke primer tussen de 55°C – 72°C. Beide primers moeten eenzelfde smeltpunt hebben. Hoe langer de primer is des te hoger is het smeltpunt.

Een primer mag geen homoloog stukje groter dan 3 baseparen bevatten, omdat anders de primer tijdens de periode van paring kan dubbelvouwen en zo een dubbele streng met zich zelf kan maken, waardoor de primer niet aan de te repliceren DNA-streng gaat zitten. Ook mogen de twee primers geen homoloog stukje bevatten, omdat anders de twee primers met elkaar hybridiseren.

Een primer moet uit ongeveer 45% tot 55% GC nucleotiden bestaan en mag geen PolyG of PolyC stukjes bevatten, omdat anders geen specifieke paring optreedt. Poly A en Poly T stukjes moeten voorkomen worden, omdat deze de efficiëntie van de amplificatie nadelig beïnvloeden. Ook polypyrimidine (T, C) en polypurine (A, G) stukjes mogen niet in een primer voorkomen.

Aan het 3' eind van de primer moet een C of een G zitten, omdat deze nucleotiden door drie bruggen een sterkere waterstofbrug vormen.

[bewerk] PCR

PCR is een techniek om DNA-strengen vele malen te vermenigvuldigen.

1. Door de DNA te verhitten tot tussen de 90 en 96°C gaan de twee strengen uit elkaar (denaturatie).
2. Vervolgens hechten de primers zich bij een tot tussen de 60 en 68°C langzaam dalende temperatuur aan de twee enkelvoudige DNA-strengen.
3. Bij 72°C wordt door DNA polymerase de primer richting 5' verlengd, waardoor er twee stukken dubbele DNA-strengen ontstaan.
4. Nu worden deze stukjes weer door verhitting gesplitst in enkelstrengs DNA enz. Daar de aanwezige primers voorkeursparing hebben met de twee enkelstrengs DNA die een verlenging zijn van deze primers worden alleen deze DNA stukken gerepliceerd. Na enkele cycli is er zoveel DNA aangemaakt dat deze aangetoond kan worden met gelelektroforese.