AFLP

Из пројекта Википедија

Полиморфизам дужине амплифицираних фрагмената односно AFLP (на енглеском Amplified Fragment Length Polymorphism) је један од најзначајнијих и најкоришћенијих протокола у великом броју биолошких дисциплина. Има примену од молекуларне биологије и генетике до микробиологије и екологије. У последњој деценији двадесетог века има огроман значај у судској медицини, јер је један од протокола коришћен за генотипизацију. Сам протокол је прошао кроз већи број модификација и усавршвавања, и данас се за као званичног креатора протокола узима Питер Вос, који је 1995 објавио рад под именом Истраживање Нуклеинских Киселина.

AFLP протокол се састоји од следећих корака:

• Дугачак ДНК ланац се сече са рестриктивним ензимима. Ензим је биолошки каталист који има велику улогу у реакцијама. Рестриктивни ензим се користи у молекуларној биологији као секач, који увек сече оба ланца ДНК молекула. Рестриктивни ензими се састоје од одређеног броја нуклеотида, дакле имају тачно одређену секвенцу. На пример, ако рестриктивни ензим има секвенцу 5−'АТТАТТА−3', када иде дуж ДНК молекула у реакцији, сваки пут кад наиђе на горе наведену секвенцу на ДНК молекулу, ензим ће да пресече ланац на томе делу. Ензими који се најчешће користе су они који имају четири до шест нуклеотида. Током реакције користе се по два рестриктивна ензима, један од шест нуклеотида други од четири, који секу ДНК молекул на сваком месту на којем идентификују своју секвенцу.

• Тако исечени ДНК фрагменти на једном крају имају секвенцу шесточланог рестриктивног ензима док на другом крају фрагмента се налази секвенца четворочланог ензима. Фрагменти се онда путем ензима Лигаза, који има улогу лепка, споје, тако да сваки фрагмент се споји са одговарајућим фрагментом. На пример, крај фрагмента који садржи секвенцу четворочланог ензима ће се спојити са другим фрагментом који такође на једном крају има ту исту секвенцу.

• Преамплификација је следећи корак у којем се у реакциону смешу стављају прајмери који су комплементарни сеченим секвенцама и на тај начин се цео фрагмент продужава.

• Селективна амплификација је следећи и последњи корак у којем се у реакциону смешу стављају унапред одређени прајмери са нама познатим секвенцама, и зато се овај корак и зове селективна амплификација јер је секвенца контролисана, тј селективна.

Када се горе наведени хемијски процес заврши, добијемо раствор који можемо да анализирамо. Анализа се врши путем електрофорезе, где се ДНК молекул раздваја на основу величине фрагмената захваљујући електричном пољу.

Захваљујући овом протоколу могуће је уочити јасне разлике од гела до гела након електрофорезе, и на овај начин се врши генотипизација, односно генетска идентификација.

[уреди] Литература

• Vos P. et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Research (1995) 23: 4407-4414 [[1]]