Plaková metoda
Z Wikipedie, otevřené encyklopedie
Plaková metoda (plotnová metoda) se používá v bakteriologii ke stanovení počtu fágových částic v suspenzi, které jsou schopny tvořit plaky. Plaky jsou vždy odvozené od jedné infekční částice.
fágové částice schopné tvořit plaky = (anglicky:) plaque-forming units = (zkratka) PFU
Postup označujeme jako titraci.
[editovat] Příklad: Stanovení počtu fágových částic ve fágovém lyzátu plakovou metodou
Příprava bakteriální suspenze: Staphylococcus aureus SA 812 přeneseme bakteriální kličkou do 10 ml roztoku MPB v Ehrenmaierově baňce a kultivujeme přes noc na třepačce při 30 °C. 1 ml suspenze přidáme do 50 ml MPB a kultivujeme 4 hod. na třepačce při 35 °C. Suspenzi zředíme 0,22 % vodný roztokem CaCl2 v poměru 1 ml CaCl2 : 9 ml suspenze. Inkubujeme 10 min.
Stanovení počtu fágových částic v lyzátu plakovou metodou: Do čtyř zkumavek pipetujeme 0,9 ml fosfátového pufru. Do první zkumavky přidáme 100 μl ředěné suspenze fága a protřepeme. Do druhé zkumavky přidáme 100 μl ředěné suspenze fága s pufrem z první zkumavky a protřepeme. Takto postupujeme až do 4. zkumavky. Do čtyř zkumavek pipetujeme po 0,9 ml suspenze SA 812 s CaCl2. Ze zřeďovací řady postupujeme od největšího zředění k nejmenšímu a přenášíme vždy 100 μl suspenze fága s pufrem do zkumavek se suspenzí SA 812 s CaCl2. Další čtyři zkumavky předehřejeme na vodní lázni 47 °C. Do těchto zkumavek napipetujeme po 3 ml 0,6 % MPA rozvařeného na vodní lázni. Znovu dáme zkumavky temperovat na vodní lázeň 47 °C. Připravíme si 4 Petriho misky s 0,8 % MPA. Na boční stranu misek napíšeme centrofixem monogram a zředění. Postupně pipetujeme od největšího zředění po 100 μl suspenze SA 812 s fágem do zkumavek s vytemperovaným 0,6 % MPA, protřepeme a ihned nalijeme na agarovou plotnu do Petriho misek. Rozprostřeme po celém povrchu plotny a necháme ztuhnout. Obrácené dnem vzhůru umístíme do dalšího dne v termostatu při 37 °C. Další den spočítáme plaky v jednotlivých Petriho miskách. Nakonec vypočteme počet PFU na 1 ml fágového lyzátu.