Enzyme giới hạn
Bách khoa toàn thư mở Wikipedia
Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE) là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu. Những enzyme này phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases. Các liên kết hóa học mà bị enzyme này cắt có thể được nối trở lại bằng loại enzyme khác là các ligases, vì thế các phân đoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắt RE) mà bị cắt từ các nhiễm sắc thể hoặc gene khác nhau có thể được ghép cùng nhau nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau (xem chi tiết phía dưới). Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền đều dựa vào các enzyme giới hạn. Thuật ngữ giới hạn xuất phát từ việc các enzyme này được khám phá từ các chủng E. coli mà đang hạn chế sự phát triển của các bacteriophages. Vì thế enzyme giới hạn được cho là cơ chế của vi khuẩn nhằm ngăn chặn sự tấn công của virus và giúp loại bỏ các trình tự của virus.
Mục lục |
[sửa] Vị trí điểm cắt
Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng có trật tự nhất định gọi là trình tự nhận biết. Vị trí điểm cắt của enzyme giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này.
Một số enzyme tạo ra các vết cắt trên mạch đối diện tức thời, tạo ra các đoạn DNA "đầu bằng (blunt)". Hầu hết các en đều tạo ra các vết cắt hơi chéo nhau (hình chữ chi), tạo ra các "đầu dính". Các enzyme giới hạn có ba chức năng quan trọng, mỗi chức năng cắt DNA bằng các cơ chế khác nhau.
[sửa] Fragment complementarity and splicing
Vì các enzyme giới hạn khác nhau ở các trình tự nhận biết và điểm cắt, nên chiều dài và trình tự chính xác của đầu dính "nhô ra", cũng như không biết nó có phải là mạch đầu 5' hay đầu 3' mà những phần nhô ra phụ thuộc vào enzyme tạo ra sản xuất ra nó. Base-pairing giữa những phần nhô ra và các trình tự bổ sung cho phép hai phân đoạn có thể nhập lại với nhau hay "splice" bởi DNA ligase. Phân đoạn có đầu dính có thể được gắn không chỉ với phân đoan lúc mới bị cắt đầu tiên, mà còn với bất kỳ phân đoạn nào mà có đầu dính thích hợp. Nếu RE có điểm cắt pallindromic không bị phân giải, thì tất cả các đầu mạch mà nó tạo ra đều thích hợp. Kiến thức về điểm cắt cho phép các nhà sinh học phân tử dự đoán được cách mà các phân đoạn có thể hắn kết và có thể chọn ra enzyme thích hợp.
[sửa] Cách sử dụng
- See the main article on restriction digests.
Các trình tự nhận biết điển hình dài từ 4-12 nucleotide. Do chỉ có một số cách để sắp xếp 4 nucleotide--A,C,G và T-- thành 4 hoặc 8 hoặc 12 trình tự nucleotide, nên các trình tự nhận biết có khuynh hướng "crop up" bằng cách thay đổi bất kỳ trình tự dài nào. Hơn nữa, RE đặc hiệu với hàng trăm trình tự đã được nhận dạng và tổng hợp để cung cấp cho các phòng thí nghiệm. Kết quả, As a result, "các điểm giới hạn" tiềm ẩn xuất hiện trong hầu hết các gene hoặc chromosome. Trong khi đó, một số các trình tự the plasmid nhân tạo bao gồm "linker" có chứa hàng tá trình tự nhận biết RE bên trong đoạn DNA rất ngắn. So no matter the context in which a gene naturally appears, there is probably a pair of restriction enzymes that can snip it out, and which will produce ends that enable the gene to be spliced into a plasmid (i.e. which will enable what molecular biologists call "cloning" of the gene).
Một cách sử dụng khác nữa của RE có thể tìm gặp trong các SNP đặc biệt. Nếu RE được tìm thấy như thế thì nó chỉ cắt 1 allele thích hợp của DNA (đó là nucleotide linh động của SNP tạo ra điểm giới hạn không tồn tại lâu bên trong đoạn DNA), this restriction enzyme can be used to genotype the sample without completely sequencing it. The sample is first run in a restriction digest to cut the DNA, then gel electrophoresis is performed on this digest. If the sample is homozygous for the common allele, the result will be two bands of DNA, because the cut will have occured at the restriction site. If the sample is homozygous for the rarer allele, the sample show only one band, because it will not have been cut. If the sample is heterozygous st that SNP, there will be three bands of DNA.
[sửa] Many Recognition sequences are palindromic
While recognition sequences vary widely, many of them are palindromic; that is, the sequence on one strand reads the same in the opposite direction on the complementary strand. The meaning of "palindromic" in this context is different from what one might expect from its linguistic usage: GTAATG is not a palindromic DNA sequence, but GTATAC is.
[sửa] Phân loại
Restriction enzymes are classified biochemically into three types, designated Type I, Type II and Type III. In type I and III systems, both the methylase and restriction activities are carried out by a single large enzyme complex. Although these enzymes recognize specific DNA sequences, the sites of actual cleavage are at variable distances from these recognition sites, and can be hundreds of bases away. In type II systems, the restriction enzyme is independent of its methylase, and cleavage occurs at very specific sites that are within or close to the recognition sequence. The vast majority of known restriction enzymes are of type II, and it is these that find the most use as laboratory tools.
[sửa] Tên gọi
Restriction enzymes are named based on the bacteria in which they are isolated in the following manner:
| E | Escherichia | (genus) |
| co | coli | (species) |
| R | RY13 | (strain) |
| I | First identified | Order ID'd in bacterium |
[sửa] Thí dụ minh hoạ
Enzyme Source Recognition Sequence Cut
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC 5'---G AATTC---3' 3'CTTAAG 3'---CTTAA G---5'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC 5'---G GATCC---3'
3'CCTAGG 3'---CCTAG G---5'
HindIII Haemophilus influenzae 5'AAGCTT 5'---A AGCTT---3'
3'TTCGAA 3'---TTCGA A---5'
MstII Microcoleus species 5'CCTNAGG
3'GGANTCC
TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA 5'---T CGA---3'
3'AGCT 3'---AGC T---5'
NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG
HinfI Haemophilus influenzae 5'GANTC
3'CTNAG
AluI* Arthrobacter luteus 5'AGCT 5'---AG CT---3'
3'TCGA 3'---TC GA---5'
* = blunt ends
